Co-IP实验步骤

免疫共沉淀实验步骤：

1 将转染质粒48 h后的293T细胞用冰1×PBS洗涤一次，加入1ml预冷的IP buffer裂解液（含PMSF），冰上30min裂解细胞。

2将细胞裂解液收集于1ml EP管中，在4℃ 12000rpm离心10 min，取上清，加入4μg 抗体于4℃振摇2h（抗体的量和振摇时间可根据抗体特异性适当调整）。（阴性对照组为相同的种属的抗体）

3 样本组和对照组中分别加入50 μl prorein A/G 树脂在4℃振摇过夜。用IP buffer洗涤3次，每次4℃ 12000rpm离心5min，弃上清。加入40μl 2×上样缓冲液。沸水中煮10 min变性蛋白。取20μl蛋白样品上样，在SDS-PAGE后，转移质PVDF膜，用相应抗体进行检测。

IP buffer

20mM Tric-Hcl

137mM NaCl

10% Glycerol

1% Np-40

1mM EDTA

注意事项：

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

（3）使用对照抗体：

单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体：正常兔IgG

（4）吸取珠子的枪尖最好将口开大（剪掉尖头部分），以免损伤珠子。

(5) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

(6) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

(7) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

（8）如何选择prorein A/G 树脂见abcam IP 实验步骤。