注意:每人答案务必不能完全一样
4．试述酵母双杂交系统的原理、构建及基本用途。(12分)
第一种答：酵母双杂交系统 是一项专门用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的技术，它首先由Fields S和Song OK于1989年提出。这项新技术在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与特定靶蛋白呈特异性作用的候选蛋白的研究中已经得到了广泛的应用。其可行性和有效性已被证实，并被推广到了诸如信号传导、细胞周期调控、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。
酵母双杂交系统的原理 酵母双杂交系统技术使用蛋白质的两种具有特别功能的结
构域：一种是与DNA结合的结合结构域（简称BD），另一种是激活DNA转录的激活结构域 （简称AD）。研究表明，这两种结构域并不需要一定在同一个蛋白质上才起作用。事实上，一个含有BD的蛋白质在与另一个含有AD的蛋白质结合以后就可以激活转录，该原理构成了酵母双杂交技术的基础。
在双杂交系统中，两种融合蛋白被表达：一种是目标蛋白—X，
它有时被形象地称为诱饵蛋白。X在它的N-端与BD融合在一起；另一种是潜在的能够与X结合的目标蛋白—Y。Y与AD融合在一起。如果X与Y相互作用，那么XY的结合就形成一种完整的活性转录激活物。如此形成的转录激活物能够驱动一个容易检测的报告基因的表达。于是，报告基因的表达量可以用来作为测定X与Y相互作用的尺度。
酵母双杂交系统的建立 1. 选择载体 2. 将“诱饵”蛋白X的基因和目标蛋白Y的基因分别插入到BD
载体和AD载体之中，以形成BD-X和AD-Y融合蛋白
3. 转染：使用特定的手段将重组后的BD-X载体和AD-Y载体转
染到特定的营养缺陷型酵母宿主细胞；
4. 筛选：利用双营养缺陷型的恢复筛选出同时含有BD载体和
AD载体的细胞；
5. 活性检测。 应用：
1. 发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
2. 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
3. 筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响 4. 建立基因组蛋白连锁图
第二种答：基本原理：酵母的转录活化因子GLA4含有两个功能结构域：氨基端的DNA结合结构域（BD）和羧基端的转录激活结构域（AD）。它们彼此分
开时，各自仍具有各自的功能。Fields根据此特征设计了双杂交系统。 （4）
构建过程：构建两个重组质粒：一个表达BD，另一个表达AD。如果在BD基因上再接上一个蛋白X基因，在AD基因上接上一个Y基因，将这两个质粒导入酵母菌中。这样，如果X、Y蛋白在酵母核内发生交互作用，则相当于将GAL4蛋白的BD和AD又重新连在一起，可以激活转录下游报告基因GAL1-lacZ的表达。通过测定β-半乳糖苷酶的活性来检测蛋白交互作用的发生。 （6） 应用：检测蛋白与蛋白之间的相互作用。 （2） 5.简述乳糖操纵子如何通过正负调控机制进行基因表达调控的?（共８分） 答：（1）阻遏蛋白的负调控：
①当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵基因
②当无诱导物时，阻遏蛋白结合与启动子与蛋白质部分重叠不转录 （2）CAP正调控：
①当细胞内缺少葡萄糖时，ATP-CAMP结合，CRP生成CAP与CAP位点结合，增强RNA聚合酶转录活性。
②当有葡萄糖存在时CAMP分解多合成少，CAP不与启动子上的CAP位点结合，RNA聚合酶不与操纵子区结合无法起始转录,结构基因表达下降。 6.什么是miRNA以及它的特点及研究miRNA重要意义。(12分)
miRNA是指微RNA，其长度通常为21nt~25 nt，由内源基因编码（如线虫
体内发现的lin-4和let-7，长度分别为22 nt和21 nt），前体含有不完善的发夹结构，能够识别多个目标，通常与目标mRNA的3′-UTR结合，从而阻止它们的翻译，但并不导致目标mRNA的水解
。
概念：是广泛存在于真核生物中的一类内源性非编码小分子RNA，它是由
约19~25个核苷酸组成。它本身不具有开放阅读框架(ORF) 。 （2）
特点与意义：
（1）表达具有组织特异性和阶段特异性。即：在不同组织中表达有不同类型的miRNA,在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达。 （2）（2）miRNA具有高度保守性，即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体。 （2） （3）与靶mRNA 3’-UTR结合，序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达。一些偏大的miRNA (27nt)可能参与了基因组的重组装。 （2） （4） miRNA独有的特征：其5’端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。 （2） （5） miRNA执行一定的生物学功能：在生长发育、信号转导、免疫调节、细胞周期、细胞的分化、增殖和凋亡以及肿瘤发生等方面发挥着重要作用。（2） 1、RNA干扰的发现和原理
RNA干扰是指通过双链RNA使目的mRNA降解，从而特异性地抑制目的蛋白表达的现象。 RNA干扰是普遍存在于真菌、植物、果蝇等各类真核生物之中的现象，类似于一种古老的免疫机制。
1990年，Napoli教授在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象（cosuppression）[1]。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段，连上花椰菜花叶病毒的35S启动子，连入农杆菌的T-DNA质粒，在矮牵牛花中过度表达。她原先预期，查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色，但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色，内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。
1998年，Andrew J. Hamilton教授研究了番茄ACC氧化酶基因的基因共抑制现象。他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后ACC氧化酶基因的mRNA和成熟mRNA。实验结果表明，外源重组基因片段能成功转录，但是mRNA成功转录出后，因为某种原因发生了转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing PTGS）[2]。因此，Andrew J. Hamilton认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。 1998年，Fire和Mello课题组接手了Guo教授研究的秀丽新小杆线虫发育过程中的一个关键基因par-1[3]的课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型，发现在Guo的课题中，引发线虫par-1基因沉默的是小片段的双链RNA[4]，而不是正义单链RNA或负义单链RNA。他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的unc-22基因，进一步阐述了双链RNA在基因沉默中的作用，并创造性地使用了“RNA干扰”这个名词。
他们的研究成果激起了其他科学家研究RNA干扰现象的浓厚兴趣，由于他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的，具有普遍性的机制，Andrew Fire, Craig C. Mello两位科学家因此在2006年获得诺贝尔奖 2. RNA干扰的原理 2.1 线虫中的RNA干扰模型
Tabara教授于1999年以秀丽新小杆线虫为模型，揭示了RNA干扰的原理[5]。线虫细胞上的跨膜蛋白SID-1引导细胞外的长链双链RNA进入细胞质，RNA立即与细胞质内的RDE-4，RDE-1蛋白形成复合体。然后DCR-1与DRH-1蛋白与该复合体结合，DCR-1蛋白将长链RNA切断，得到RDE-1结合的siRNA（小干扰RNA）复合物。RDE-1-si-RNA复合物在解旋酶的作用下解链，RDE-1蛋白脱去，RISC酶与正义链和反义链中的一条链结合，RISC-单链RNA复合物在引导下与靶mRNA结合。反义RNA与靶mRNA上同源的部分特异性结合，在RISC的作用下，靶mRNA链被切断，无法与核糖体结合，翻译成蛋白质，引起基因沉默。同时，以反义RNA为引物，以mRNA为模板，在RdRP（RNA依赖性RNA聚合酶）的作用下，生成新的siRNA反义链。这就是siRNA的级联放大的机制。
RNA干扰现象介导的mRNA降解特异性强，同时由于放大机制的存在微量siRNA就能引起明显的RNA干扰现象。[6]线虫中的RNA干扰机制比较典型，但是在高等生物中，RNA的机制又有细微差别。 2.2 高等植物细胞中的RNA干扰机制
植物细胞中在细胞核内产生的内源性miRNA（微小干扰RNA）参与了植物的基因表达的调控。植物miRNA多数长21个碱基，具有保守性，它的产生，是由miRNA前体长链dsRNA经Dicer酶家族（与DCR-1类似，常被称为DCL1、DCL2等）切割产生。 以下机制为高等植物所特有[7] ① 干扰机制依赖于Ago蛋白家族，该家族有10个成员，它们在siRNA积累，DNA甲基化作用中起着关键作用，在整个RNA干扰的转录后基因沉默（PTGS）机制中起调节作用 ② Dicer酶家族在高等植物中有特异性，共4个成员，称之为DCL1~DCL4它们与miRNA的成熟有关。同时，miRNA的成熟需要植物细胞特有的HYL1这种双链RNA结合蛋白的参与 ③ 植物中特有的RDRs（RNA依赖的RNA多聚酶），它的作用机制与昆虫，哺乳动物有明显差异
2.3 哺乳动物的RNA干扰机制
哺乳动物的RNA干扰机制与高等植物稍有不同，主要表现在以下几方面： ① 动物miRNA的长度多为22~24个碱基，比植物长 ② 动物miRNA的前体比植物miRNA的前体短得多，后者的长度是前者的三倍。 ③ 动物miRNA由Drosha（与Dicer酶类似）、RNaseⅢ在细胞核、细胞质中分两步完成，而该步骤在植物细胞的细胞核中完成 ④ 动物miRNA在切断mRNA时，通常喜欢在3’非翻译区域结合 ⑤ 哺乳动物如人类，小鼠等具有较发达的免疫系统，外源性大片段dsRNA会引起干扰素样反应，蛋白酶R（PKR）被激活，有时还能激活寡聚腺苷合成酶（OAS）通路，使得细胞内蛋白质翻译停止，细胞死亡，该现象不出现在植物细胞中。 2、真核与原核生物基因表达调控的区别 第一种解答：
调控的原因：原核生物基因表达调节的目的是为了更有效和更经济地对环境的变化做出反应，而多细胞真核生物基因表达调节的主要目的是细胞分化，它需要在不同的生长时期和不同的发育阶段具有不同的基因表达样式；
调控的层次：原核生物基因表达调控主要集中在转录水平，但真核生物基因表达的转录后水平调节与其在转录水平上的调节各占“半壁江山”，而某些调控层次是真核生物特有的，比如染色质水平、RNA后加工水平和mRNA运输等；
调控的手段：原核生物绝大多数的基因组织成操纵子，但真核生物一般无操纵子结构。
第二种解答：
原核生物的机体能在基因表达过程的任何阶段进行调控，如调控可在转录阶段、转录后加工阶段和翻译阶段进行。转录的调控主要发生在起始阶段，这样可避免浪费能量合成不必要的转录产物。通常不在转录延伸阶段进行调控，但可在终止阶段进行调控，终止可以防止越过终止子而进行下一个基因的转录。RNA的初级转录产物本身是一个受调控的靶分子，转录物作为一个整体其有效性可以受到调控，例如，它的稳定性可以决定它是否保存下来用于翻译。此外，初级转录产物转变为成熟分子的加工能力可决定最后mRNA分子的组成和功能。在真核细胞中，还可对RNA从核到胞浆中的转运进行调控。但是在细菌中，mRNA只要一合成，就可用于翻译。翻译也像转录一样，在起始阶段和终止阶段进行调控。DNA转录的起始和RNA翻译的起始路线也很相似。
真核生物基因表达的调控要比原核生物复杂得多，特别是高等生物，不仅由多细胞构成，而且具有组织和器官的分化。细胞中由核膜将核和细胞质分开，转录和翻译并不是偶联，而是分别在核和细胞质中进行的，基因组不再是环状或线状近于裸露DNA，而是由多条染色体组成，染色体本身结构是以核小体为单位形成的多极结构，真核生物的个体还存在着复杂的个体发育和分化，因此说真核生物的基因表达调控是多层次的，从DNA到RNA到有功能蛋白质多途径进行调控的。主要的调控途径有如下几个方面：
①DNA和染色体水平上的调控：基因的拷贝数扩增或丢失和基因重排，DNA修饰，在染色体上的位置，染色体结构（包括染色质、异染色质、核小体）都可影响基因表达。
②转录水平上的调控：转录起始的控制和延伸的弱化对mRNA前体的水平都会产生影响。
③转录后RNA加工过程和运送中的调控：真核基因转录出的mRNA前体，要经过加工才能成熟为mRNA，包括切割、拼接、编辑、5`和3`末端修饰等，成熟的mRNA再运出细胞核。
④翻译水平上的调控：5`端前导序列形成茎环结构降低翻译水平或抑制蛋白结合5`端，阻止mRNA的翻译。
⑤翻译后的调控：翻译后产生的蛋白质常常需要修饰和加工如磷酸化、糖基化、切除信号肽及构象形成等，才能成为有活性的蛋白质，可以利用这个过程有选择地激活或灭活某些蛋白质。
⑥mRNA降解的调控：控制mRNA寿命就能控制一定数目的mRNA分子产生蛋白质数量，这种调控是由mRNA 3`端的序列决定的。 3、2014年诺贝尔生理学或医学奖的研究成果和对人类的影响 奥基夫和位置细胞
约翰·奥基夫(John O’Keefe)
1939年出生于美国纽约市，拥有美国和英国国籍。他在1967年，他在加拿大麦吉尔大学(McGill University)获得了生理心理学博士学位。在这之后，他到英国伦敦大学学院
(University College London)读博士后。1987年，他留校担任认知神经科学教授。目前，约翰·奥基夫教授是伦敦大学学院神经回路与行为中心主任。
约翰·奥基夫的贡献在于，他最早发现了动物和人类大脑中的位置细胞，这种位置细胞是构成大脑定位系统的关键细胞之一。
奥基夫分析认为，这些被激活的细胞就是小鼠感知自身位置的位置细胞，这些位置细胞并非只是简单地接收视觉信息，而是在构建小鼠辨识自己所在房间的“大脑地图”。同时，海马体会根据不同的环境产生大量的地图，动物处于不同环境时这些地图由大量神经细胞共同作用而形成。因此，生物体对环境的记忆可以用海马体中神经细胞特定激活组合的方式来进行存储。
当然，奥基夫的发现只是阐明了大脑定位系统的一个方面，还不能全面解释人们是如何感知自己所处的方位以及在运动和行走中是如何辨别距离的，余下的工作则由莫泽夫妇来完成，而梅·布里特·莫泽又曾师从奥基夫。 莫泽夫妇和网格细胞
梅-布里特·莫泽(May-Britt Moser)
1963年出生于挪威福斯纳沃格，挪威国籍。她在奥斯陆大学与她后来的丈夫、共同获奖者爱德华·莫泽(Edvard Moser)一共学习心理学。1995年，她获得神经生理学博士学位。她是爱丁堡大学的博士后研究员，随后在英国伦敦大学学院做访问学者，然后在1996年到位于特隆赫姆的挪威大学科学与技术学院工作。2000年，梅-布里特·莫泽被任命为神经科学教授，目前是特隆赫姆神经计算中心的主任。
莫泽夫妇的贡献在于，他们发现了大脑定位系统中的另一种细胞——网格细胞。这些细胞产生一种“坐标体系”，从而让精确定位与路径搜寻成为可能。他们后来的研究还揭示了位置细胞以及网格细胞是如何让定位与导航成为可能的。
莫泽夫妇反复对小鼠进行实验发现，当小鼠经过更广阔和复杂的地形时，其大脑临近海马体的另一个名叫内嗅皮层部位的神经细胞发生激活。这些细胞都会对特定的空间模式或环境作出反应，它们在整体上构成所谓的网格细胞。这些细胞组成一个坐标系统，就像人们绘制的地图以经线和纬线来划分一个个不同方向和位置，从而让空间和地面导航成为可能。
而且，内嗅皮层区域的其他细胞能够判断自身头部对准的方向以及房间的边界位置，这些细胞与位于海马体内的位置细胞相互协调，构成一个完整的神经回路。这个回路系统构成了一个复杂而精细的定位体系，这就是人们大脑中的定位系统。
当然，大脑定位系统的发现在医学领域更具意义。脑功能障碍是最常见的残疾原因，却一直未能发现有效的防治方法。在很多脑疾病中都有空间记忆功能受损
的影响。以阿尔茨海默病患者为例，海马体和内嗅皮层经常在早期阶段受到影响，导致患者常常迷失方向，无法识别外界环境。了解大脑的定位系统可以帮助我们从机制上去了解这类患者的记忆是如何丧失的，而且还能依靠这一发现为防治阿尔茨海默病提供线索。
7、真核与原核生物蛋白质合成的区别
1.起始复合物形成所需的蛋白质因子的差异
原核生物起始因子主要有IF1,IF2,IF3等3种，而真核生物就目前所知，起始因子就有9种左右，其中eIF2由3个亚基组成，而elF4按其参与复合物的作用不同区分为
4A,4B,4C,4E,4F。而形成的复合物4F称为帽子结构因子elF4E与mRNA帽子结构结合。 2.起始复合物形成过程的次序差异
真核生物蛋白质合成德尔起始过程分为三步：43S起始复合物的形成；48s起始复合物的形成和80s起始复合物的形成。 1）43s起始复合物的形成
小亚基40s核糖体首先与起始因子elF3和elF4C结合生成43s核糖体复合物，然后再与elF2•GTP•Met-tRNAi复合物结合形成43s前起始复合物。而原核生物在起始因子IF1、IF2、IF3和GTP促使下形成复合物后，与mRNA结合生成复合物再与fMet-TrnafMet 结合生成30s前起始复合物。 2）48s起始复合物的形成
真核生物43s前起始复合物与mRNA结合成48s前起始复合物。mRNA复合物含有CPB1,elF4A、elF4B和elF4F。在有ATP条件下，这些因子一起生成复合物。原核生物无此步骤。
3）80s起始复合物的形成
48s前起始复合物生成后，在延长因子elF5作用下，释放出elF2 •••••GDP •Pi和elF3,elF4C,接着60s大亚基核糖体便与小亚基结合而生成80s起始复合物。 3.肽链延长和终止过程
真核生物蛋白质合成过程中的肽链延长，由延长因子EF1α、EF1βγ作用下进行的。EF1α与GTP，氨基酰-t RNA形成复合物，促使氨酰-t RNA进入核糖体。EF1βγ催化GDP与GTP交换，利于EF1α循环利用。而移位是由EF2作用进行的，相当于原核生物的EF-G，它催化GTP水解和驱动氨基酰-t RNA从A位移到P位。
终止过程由释放因子RF识别UAA或UAG或UGA终止密码。它使肽酰基转移酶变构成具有水解肽酰基与t RNA之间的酯键，释放出新合成的肽链，在终止过程中需GTP供能。而原核生物的终止密码分别由RF1和RF2识别。
真核生物和原核生物蛋白质合成的肽链延长和终止过程非常相似，除因子的种类和名称不同外，没有更明显的差别。
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