一、实验目的
以紫外线诱变获得植酸酶高产菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法，掌握紫外线作用的机理，熟悉紫外线诱变的步骤，懂得存活率的计算，学会优良菌株的筛选方法。
二、实验原理
紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。
外线诱变一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20~30 cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在70％~80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。 本实验以紫外线处理植酸酶产生菌，通过透明圈法初筛，选择酶活力高的生产菌株。
三、实验内容：
1．对植酸酶出发菌株进行处理，制备细胞悬液；2．用紫外线进行诱变处理；3．用平板透明圈法进行初筛；统计透明圈个数及C/H值。
四、实验材料和用具
植酸酶产生菌摇瓶菌种；植酸酶产生菌筛选平板
三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。
五、操作步骤
(一)出发菌株的选择及菌悬液制备
1．出发菌株的选择 自然界筛选得到的高产植酸酶的菌株，取一环接种于盛有20 mL培养基的250mL三角瓶中，37℃振荡培养12h，即为对数生长期的菌种。 2. 菌悬液制备 取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000r/min离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。加入无菌水9mL，振荡均匀。细胞浓度为106～108个/mL，冷冻保藏备用。
(二)诱变处理
用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。
1．紫外线处理 打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，及时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。
2．稀释菌悬液 按10倍稀释至10，从10和10中各取出0.lmL加入到筛选平板中(每个稀释度均做3个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养3～4d。
(三)优良菌株的筛选
1.首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，计数并测量其菌落直径与透明圈直径之比。
2．观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值最大者接入斜面保藏。
3.通过钒钼酸铵钼蓝法来检测粗筛得到的高产菌株的酶活，优良进行低温保藏。
六、注意事项
1.紫外线对人体和细胞有危害，尤以人的眼睛和皮服，如较长时间暴露在紫外线下，会造成灼伤。故操作者需戴防护眼镜，身穿工作服。
2．装卸灯管时，避免手指直接接触灯管表面，以免造成灯管失透现象，影响杀菌能力。灯管开启前，用脱脂棉沾酒精擦灯管，可防止失透。
3．空气在紫外线灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有 一定的杀菌作用，但高浓度的臭氧会引起人体不舒服，故臭氧在空气中的含量不能超过0.1-1% 为宜。
4.诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。 七、实验结果
1.试列表说明高产植酸酶菌株的筛选结果（透明圈个数，C/H值的大小）。 2.高产植酸酶菌株的酶活。 八、问题和思考
1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。 2．为什么在诱变前要把菌悬液培养一段时间？
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