游玟娟 紫外线诱变选育酸性 一淀粉酶高产菌株 文章编号：１００６—８４８１（２０１０）０３—０００９—０３ 紫外线诱变选育酸性 一淀 高产菌株 游玟娟 （湖南化工职业技术学院，湖南株洲４１２００４） 摘要：为了提高菌株产酶能力，研究了紫外线处理对枯草芽孢杆菌ＢＦ ７６５８产酸性０【一淀粉酶的影响。结 果表明：采用３０ ｗ紫外线照射９０ Ｓ获得较好的突变效果，利用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛，筛选得到一 株理想的突变株ｕＶ一１２，其酶活为３４１８．８ Ｕ／ｍＬ，比出发菌株提高了５９．７％。对ｕＶ—ｌ２进行紫外线二次诱 变，酶活提高不显著，表现出一定“抗性”。 关键词：枯草芽孢杆菌；酸性ｅｔ一淀粉酶；紫外线；诱变 中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ｂ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｃｉｄ 一ａｍｙｌａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ—ｖｉｏｌｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ＹＯＵ Ｗｅｎ——ｊｕａｎ （ｔｔｕｎａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｈｕｚｈｏｕ，Ｈｕｎａｎ，４１２００４） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ，ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａ—ｖｉｏｌｅｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ａｃｉｄ ～ａｍｙ１ａｓｅ ｏｆ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＦｖ７６５８ ｉｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ３０Ｗ—ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ９０ｓ ｃａｎ ｈａｖｅ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒ—ｃｈａｎｇｉｎｇ ｃｉｒ— ｅｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ａｎ ｉｄｅａｌ ｍｕｔａｎｔ ＵＶ一１ ２ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｏｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ３４１８．８ Ｕ／ｍＬ．５９．７％ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎｓｔｅａｄ ｏｆ ａ ｃｌｅａｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｓ ａ ｃｅｒ‘ ｔａｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＶ一１２． Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ａｃｉｄ 一ａｍｙｌａｓｅ；ｕｌｔｒａ—ｖｉｏｌｅｔ ｒａｙ；ｍｕｔａｔｉｏｎ 它在淀粉深ＤＨ－＿［、酒精、食品、饲料和医药等领域 Ｕ ｝】ＩＪ舀 有广泛的应用前景 。目前酸性仅一淀粉酶大 酸性 一淀粉酶能在酸性ｐＨ条件下，以随机 多来源于微生物，产酸性 一淀粉酶的微生物主 方式切断淀粉分子内的仅一１，４葡萄糖苷键，将 要是芽孢杆菌和曲霉 Ｊ。国外已有利用黑曲霉 淀粉水解为麦芽糖、低聚糖、含ｄ一１，６键的糊 发酵生产酸性仅一淀粉酶的报道 Ｊ，但我国尚未 精 』。酸性 一淀粉酶的优点是能在酸性条件下 实现耐酸性 一淀粉酶工业化。本实验以枯草芽 发挥催化作用，从而实现淀粉同步液化与糖化，简 把杆菌ＢＦ ７６５８为出发菌株，进行紫外线诱变育 化淀粉的加工工艺，降低产品的加工成本。因此 种，旨在探索诱变条件，提高菌株产酶能力，为实 修回日期：２０１０—０４—２０ 作者简介：游玟娟（１９８１一）．步湖南通道市人，本科。研究方向：微生物遗传育种。 ・９・ ｜ 羹≥ 《江苏调味副食￣）２ｏｌｏ年第２７卷第３期（总第１２３期） 现酸性 一淀粉酶工业化生产奠定基础。 光培养３６ ｈ，计算致死率。喷洒碘液后，挑选单菌 １材料和方法 落变色圈直径与菌落直径比值Ｈ／Ｃ≥２．０的菌 株，进行摇瓶发酵实验，测定其产酶能力。 １．１菌株 １．４．４酶活力测定 枯草芽孢杆菌ＢＦ ７６５８，由本校生物制药国家 酶活力的测定采用ＤＮＳ法 。 重点实训基地提供。 酶活单位定义：在５０℃，ｐＨ值５．５的条件下， １．２主要仪器和设备 １ ｍｉｎ内从可溶性淀粉中释放出１ ｕｇ还原糖所需 ＱＹＣ．２１０２摇床，上海福玛实验设备有限公 的酶量为１ Ｕ。 司；ＶＩＳ一７２２０分光光度计，北京瑞利分析仪器有 限公司；ＣＢＶ一１５００Ａ超净工作台，上海瑞仰净化 ２结果与分析 装备有限公司；ＨＰＳ一２５０生化培养箱，哈尔滨东 ２．１诱变条件的选择 明医疗仪器厂；ＬＤＺ４—０．８Ａ离心机，北京医用离 对出发菌株分别用紫外线诱变处理，得到致 心机厂；ＨＨ．ＳＹＨ—Ｎｉ２一Ｃ水浴锅，北京长源实验 死曲线见图１。由图１可知，出发菌株对紫外线比 设备厂。 较敏感，而且致死率与诱变剂剂量存在正相关。 １．３培养基 当紫外线照射时间为９０ ｓ时，致死率为７２．８％， １．３．１斜面培养基 进一步提高照射时间，则致死率随之上升，当照射 采用牛肉膏蛋白胨斜面培养基 Ｊ。 １２０ Ｓ时，致死率为９２．６％。一般认为，进行紫外 １．３．２固体鉴别培养基 诱变时，致死率为７０％左右时突变效果最好 。 可溶性淀粉５．０ ｇ，蛋白胨１０．０ ｇ，牛肉膏３．０ 因此，紫外线诱变的最适剂量为采用３０ ｗ紫外灯 ｇ，琼脂１０．０ ｇ，ｐＨ值为７．０，水１ ０００ ｍＬ。 照射９０ Ｓ。 １．３．３液体发酵培养基 １００ 可溶性淀粉１０．０ ｇ，蛋白胨５．０ ｇ，Ｎａ：ＨＰＯ ・ ８０ １２Ｈ２Ｏ ４．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．３ ｇ，ｐＨ值为７．０，加入水 １ ０００ ｍＬ。 ６０ １．４实验方法 豁４Ｏ １．４．１ 菌种活化 将枯草芽孢杆菌接种到固体斜面培养基上， ２Ｏ 放人培养箱中，于３７％培养２４ ｈ，即得活化菌株。 Ｏ １．４．２菌悬液制备 ０ ４０ ８０ １２０ 取活化后的菌种２环于盛有１００ ｍＬ无菌水 时间／ｓ 的锥型瓶中，加入无菌玻璃珠并置摇床上振荡２０ 图１ 紫外线诱变致死曲线 ｍｉｎ，配成１０ ～ｌ０ 个／ｍＬ的菌悬液。 ２．２筛选结果 １．４．３紫外线诱变及筛选 从固体鉴别培养基上挑取Ｈ／ＣＩ＞２．０的１８株 各取５ ｍＬ菌悬液移人１８个无菌培养皿中， 菌株，按．Ｈ／Ｃ值大小排列并命名为ｕＶ一１一ｕＶ一 置于距３０ ｗ紫外灯３０ ｃｍ处的磁力搅拌器上照 １８。３７℃下摇瓶发酵４８ ｈ，测酸性仅一淀粉酶的 射１ ｍｉｎ，然后打开皿盖并开启磁力搅拌器，分别 活力。以原始菌株（ＣＫ）作对照，经过紫外线诱变 照射０ Ｓ（对照用）、５０ ｓ、６０ ｓ、７０ ｓ、８０ Ｓ、９０ ｓ、１００ 。且Ｈ／Ｃ≥２．０的菌株大部分酶活力有所提高，而 ｓ、１１０ ｓ和１２０ ｓ（各做２组）。在暗光条件下，分 且大部分Ｈ／Ｃ大的菌株其酶活也高。但也有Ｈ／ 别取经紫外线诱变的菌悬液０．１ ｍＬ涂布于１８个 ｃ值高而酶活较低的现象，例如ｕＶ一５、ｕＶ一８和 固体鉴别培养基上，倒置于３７￣Ｃ恒温培养箱中避 ＵＶ一１０等菌株。因此，Ｈ／Ｃ值只能作为初筛指标， ．１０． 游玟娟 紫外线诱变选育酸性 一淀粉酶高产菌株 要准确判断菌株产酶能力大小要经过摇瓶复筛。 育种意义不大。在合适条件下，采用单次处理就 其中ｕＶ一１２酶活最高，达到３４１８．８Ｕ／ｍＬ，比原 能得到较好的突变效果，ｕＶ一１２即为本实验的目 始菌株提高了５９．７％，具体结果见表１。因此，选 的菌株。择ｕＶ一１２作为二次紫外线诱变的出发菌株。 表１ 紫外线诱变后菌株的Ｈ／Ｃ值与酶活 ３结论 研究了紫外线处理对枯草芽孢杆菌ＢＦ ７６５８ 产酸性ｏｔ一淀粉酶的影响。出发菌株采用３Ｏ ｗ 紫外线照射９０ ｓ后，涂布于固体鉴别平板上，再利 用变色圈法结合摇瓶发酵进行筛选，得到一株理 想的突变株，并且命名为ｕＶ一１２。该菌株酶活为 ３４１８．８ Ｕ／ｍＬ，比出发菌株提高了５９．７％；实验还 发现，对ＵＶ一１２进行紫外线二次诱变，酶活提高 不显著。 紫外线诱变育种具有简便易行、对条件和设 备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量等特 点，故在微生物育种中仍广泛应用。但实验中发 现，采用单一诱变剂多次处理菌株，易出现“饱和” 现象而使诱变效果不显著。因此，在复合诱变育 种中，应采用不同的诱变剂处理，充分利用诱变剂 问的协同作用，创造更多的突变“热点”，进而提高 ．诱变效果。 参考文献 ２．３二次紫外线诱变结果 对ＵＶ一１２再次进行紫外线诱变，然后分装 于ｌ０个摇瓶，在３７￣Ｃ下发酵４８ ｈ，测酶活力，结果 见表２。 表２二次紫外线诱变的酶活 菌株编号酶活／Ｕ・ｍＬ ３４５０．６ ３５６８．５ ３３４５．８ ３２１０．６ ３４２６．３ ［１］ 张丽苹，徐岩，金建中．酸性ｎ一淀粉酶的研究与应用［Ｊ］． 酿酒，２００２，２９（３）：１９—２１． ［２］ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ Ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ— Ｓｔａｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １９９５：７９（３）：２５２—２５６． ［３］欧阳平凯．化工产品手册（第三版）［Ｍ］．北京：中国轻－Ｉ２＿ｑｋ 出版社，１９９９． ［４］ Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｍｏｆｉｍｕｒａ，Ｗｅｎ ｄｕｅ Ｚｈａｎｇ，ｅｔａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｗｈｉｔｅ Ｓｈｏｃｈｕ——Ｋｏｊｉ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ Ｈｉｇｈｅｒ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａｃｉｄ——Ｓｔａｂｌｅ ａ —菌株编号酶活／Ｕ・ｍＬ— ＵＶ一１２—６ ＵＶ一１２—７ ＵＶ一１２—８ ＵＶ一１２—９ ＵＶ一１２—１０ ３４２０．５ ３４６４．１ ３５０９．６ ３５８６．７ ３４２８．９ ＵＶ—ｌ２—１ ＵＶ一１２—２ ＵＶ一１２—３ ＵＶ一１２—４ ＵＶ一１２—５ Ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｈｅｎ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｓｈｏｅｈｕ Ｍａｋｉｎｇ ｏｎ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｃＭｅ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｔｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ，１９９９，１０５（５）：３０９． ［５］ＯＭＥＭＵ Ａ，ＡＫＰＡＮ Ｉ，ＢＡＮＫＯＩ Ｅ Ｍ，ｅｔａ１．Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｗ ｔｕ－ 从表２可知，经二次紫外诱变后酶活提高不 显著，菌株ｕＶ一１２对紫外线表现出一定的耐受 性。紫外线能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体，影响 ＤＮＡ正常解链与碱基配对，从而引起基因突变。 ｂｅｒ ｓｔａｒｃｈｅｓ ｂｙ ａｍｙｌ￣ｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＡＭ０７ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ａｆｒ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，（４１）：１９—２５． ［６］ 沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育 出版，１９９９：２１４—２１５． ［７］ 张树政主编．酶制剂工业［Ｍ］．北京：科学出版社，１９８４，４８５ 采用同一诱变剂复合处理菌株时，由于诱变位点 ． 一５３５． 是相同的，容易出现“饱和”现象，因此采用紫外线 二次处理对提高ｕＶ一１２的酶活效果不显著，对 ［８］周德庆．微生物学教程［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００２， ２１２—２１７． ・ １ １ ・