硕士学位论文中期检查报告

硕士学位论文中期检查报告

论文题目： 趋化因子CCL5及其受体CCR5在

川崎病中的表达及意义

研究生姓名： 学院： 专业： 导师姓名、职称：

三峡大学研究生处

年 月 日

说 明

一、研究生论文中期报告的各项内容，要实事求是，表达要明确、严谨，字迹要

清晰易辨，外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现缩写词，须注出全称。

二、论文中期报告由学生本人完成，完成后请导师签署意见，评议小组签署评议

意见，上述意见应明确是否同意研究生继续进行论文写作工作。

三、论文中期报告应包括以下内容：（1）论文工作是否按开题报告预定的内容及

进度安排进行；（2）目前已完成的研究工作及结果；（3）后期拟完成的研究工作及进度安排；（4）存在的困难与问题；（5）如期完成全部论文工作的可能性。

四、论文中期报告内容由研究生自附纸张完成，用A4纸张正反打印。 五、本论文中期报告由学院留存一份。

三峡大学硕士学位论文中期报告 （1）研究进度安排

川崎病是一种急性、自限性的全身血管炎，好发于5 岁以下婴幼儿。1962 年在日本首次发现，1967年日本学者川崎富作首先报道，此后欧、亚、美、澳洲及南非各地均有报道。由于本病病因未明，临床表现比较复杂，全身多系统均可受累， 尤以冠状动脉为甚，在日本和美国已经取代风湿热成为儿童获得性心脏病的最常见疾病，目前已成为最常见的小儿后天性心脏病之一，并可能为成人缺血性心脏病的危险因素之一。近年来， KD 无论在流行病学、病因及发病机制的研究以及临床诊疗上均获得了诸多进展。本论文根据预定的开题报告内容以及进度合理安排，目前已经就相关文献综述以及国内外研究现状进行了分析与总结，为本文的研究奠定了理论基础。

（2）目前已完成的研究工作及结果

本文已经对相关案例进行了预定的选取。本文选取2013年10月-2014年7月在三峡大学仁和医院、宜昌市中心医院及宜昌市二医院就诊的川崎病患儿20例，年龄波动于6月~8岁，平均年龄(2.10±1.83)岁，男：女=2:1。受检对象按入选顺序编号，如第1个入选对象编号为1。诊断标准选用美国心脏病协会制定的川崎病诊断标准：

1)发热持续5天以上，抗生素治疗无效，不能被其他已知疾病所解释； 2)双眼结膜充血(非渗出性)；

3)口唇鲜红、皲裂，口唇點膜弥散性充血，杨梅舌； 4)多形性红斑、皮瘆；

5)在急性期有手足硬肿，掌距红斑；在恢复期指(趾)端甲床皮肤移行处有膜状脱皮；

6)急性非化脓性颈淋巴结大，常为单侧，其直径>1.5cm或更大。

以上标准至少满足5项，可确诊为川崎病，其中1)为必备条件。若患儿不明原因发热超过5天，伴其他诊断标准中的3项，并经二维超声心动图或冠状动脉造影确诊存在冠状动脉扩张或冠状动脉瘤，除外其他疾病，亦可确诊。对于所有患者的一般资料进行了充分的统计，同时在此基础上对患者进行了随机分组，从

三峡大学硕士学位论文中期报告 而为后续的研究奠定基础。

（3）后期拟完成的研究工作及进度安排

后期，本文将首先就检测KD患儿表达CCL5、CCR5的具体细胞。收集KD患儿和正常对照组外周血 3- 4 ml，PBMC分离：无菌肝素钠抗凝血 3- 4ml，经Ficoll 密度梯度离心法分离提取外周血单个核细胞( PBMCs)。同时在分析以及检测的基础之上，对结果进行分析包括：

1）明确CCL5、CCR5分别在外周血PBMC中的具体表达细胞； 2）对于活化前后的T细胞，CCL5、CCR5的表达水平有何变化； 3）找到CCL5、CCR5之间在川崎病患儿中表达的联系。

经过上述比较，研究CCL5与CCR5在川崎病患儿外周血中的表达变化，从而为川崎病发病机制和治疗手段提供新的思路。研究结果如下表所示：

表1 趋化因子CCL5对T细胞趋化性影响

视野 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ 合计

0 21 26 12 40 19 14 17 9 13 171

10 50 45 44 76 55 55 35 33 14 407

20 88 82 43 55 63 76 59 47 25 538

50 57 57 14 69 29 23 41 65 20 375

100 60 60 32 61 53 40 55 32 30 423

300 52 36 60 57 43 46 30 38 36 398

500 33 36 61 66 50 53 30 47 29 405

平均数/视野 19.0±9.4 45.2±17.2 59.8±20.1 41.6±20.9 47.0±13.3 44.2±10.3 45.0±13.6

表2 CCR5阻断剂对T细胞趋化性影响

视野 ① ② ③ ④ ⑤ 合计 平均数/视野

0 50 38 44 72 78 282 56.4±17.63

10 30 23 19 25 27 124

50 18 13 12 17 9 69

100 13 12 5 5 7 42

200 10 9 5 7 9 40

24.8±4.15 13.8±3.70 8.4±3.85 8.0±2.0

图1 各组细胞内钙离子浓度的变化

通过对趋化因子CCL5/ CCR5对T细胞趋化性影响，我们的实验结论如下:

1、趋化因子受体CCL5/ CCR5在川崎病患儿外周血中高表达，提示他们可能与川崎病患儿外周血的发生和发展密切相关，另外，受体CCRS可能是川崎病标志物之一。

2、趋化因子受体CCL5在川崎病患儿外周细胞中有明确表达，且为功能性受体。

3、在实验组中加入趋化因子CCLS后SACC-83细胞内的Ca2十浓度呈现明显的

瞬时上升现象(见图1)，而利用受体CCRS阻断剂Maraviroc和CCRSmAb将细胞表面的受体CCRS阻断后，跟踪监测发现细胞内的Ca2十浓度无明显的波动变化(见图1)。

4、趋化因子CCLS与其受体CCRS结合后，对川崎病患儿外周细胞的运动性、侵袭性、趋化性和增殖效应均产生了促进作用，其机理可能是CCL5/ CCR5生物轴通过引起细胞内钙离子浓度的改变，启动了癌细胞内钙离子相关的信号。

（4）存在的困难与问题

趋化因子（chemokines）是细胞因子超家族中的成员之一，是一类对细胞具有定向趋化吸引作用的小分子蛋白质，它可以定向吸引免疫细胞参与免疫应答和免疫病理过程[12]。到目前为止，至少有50种趋化因子被发现，其由70-125个氨基酸组成，分子量在8-11KD不等。大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸形成的两个特征性的二硫键，故其有很相似的高级结构，C端为α螺旋，N 端不规则，有比较高的生物学活性，与受体相结合。

趋化因子首先作为趋化性介质被发现，但随着对趋化因子研究的深入，现在已经认识到趋化因子不但对白细胞具有趋化作用，而且在免疫细胞和器官的发育、免疫应答过程、炎症反应、病原体感染、创伤修复及肿瘤形成和转移等方面发挥广泛的生理和病理作用［14-16］。随着近年来对趋化因子及其受体研究的深入，国内外众多学者均已发现其二者结合在自身免疫性疾病中对T细胞的募集及趋化进行作用，并将相应T细胞聚集至靶器官发生组织器官损伤。Wenzel等在研究系统性红斑狼疮（SLE）时发现CXCL10及其受体CXCR3的结合可定向招募细胞毒性T 细胞进入靶器官最终造成皮肤损害；Barone 等研究表明，干燥综合征（SS）患者泪腺角膜上皮细胞CXCL9、CXCL10、CXCL11及受体CXCR3 表达均升高；Goulvestre等通过对甲状腺组织中表达的细胞因子和相应趋化因子研究，得出CCL21、CXCL12、CXCL13、CCL22在自身免疫性甲状腺疾病（AITD）患者的甲状腺组织中的表达增加，其中自身免疫性疾病甲状腺组织中有异位二级淋巴滤泡形成的CXCL12、

三峡大学硕士学位论文中期报告 CXCL13、CCL22的表达显著增加。目前对于趋化因子及其受体的研究点在于趋

化因子在自身免疫性疾病中所起的募集、趋化T细胞至靶器官的作用，但其在川崎病中的具体作用研究尚不多，目前的研究对于趋化因子CCL5及其受体CCR5在川崎病中的表达及意义研究较少，缺乏相关文献的支持以及数据的保障，同时本文研究的内容以及提取方法相对复杂。由此要求研究中必须要花费更多的精力以及时间以保证研究结果的合理性与准确性，同时也需要进一步进行文献的搜集与整理，特别是对于国外文献的搜集与调查，从而为本文的研究奠定基础。

（5）如期完成全部论文工作的可能性。

目前，已经采集了部分研究对象资料，并进行了相对应的分组及采血。同时，国内学者已进行过CCL5、CCR5在其他疾病中的表达研究，可提供相应的研究方法及路线参考。而笔者的前期预实验已分离出PBMC并成功进行了T细胞的活化增殖。因此，后续能够按照最初的进度完成论文工作，并且保证研究质量以及结论的准确性。

导师评语：

评议小组评语：