5406放线菌培养条件的优化试验

吉林蔬菜展示新形象创新发展5406放线菌培养条件的优化试验李丽

杨

倩

邢

力

秦秀丽

132101）

（吉林农业科技学院

吉林市

摘要：对5406放线菌培养条件进行优化。通过单因素试验及正交试验筛选出高氏1号加富培养基最适配方以及环境条件。试验结果表明：高氏1号加富培养基适宜配方为在高氏1号基础培养基中加入麦芽糖15g/L、牛肉膏4g/L、B120.1g/L，pH值7.5；5406放线菌生长适宜的环境条件为温度为35益，空气相对湿度为60%左右，无光或弱光条件。利用筛选出的高氏1号培养基和环境条件培养5406放线菌，菌丝生长速度快，菌落较厚，表面致密，长势好。关键词：5406放线菌；高氏1号；加富培养基；菌落直径

Optimizationtestofcultureconditionsof5406actinomycetes

Abstract：Thecultureconditionsof5406actinomyceteswereoptimized.Singlefactortestandorthogonalexperimentwereusedtoselectthemostsuitableand

environmentalconditionsofhigh-richculturemedium.Theexperimentalresultsshowedthattheappropriateformulaofthehighenrichmentmediumwas15g/L，4g/L，B120.1g/L，andpHvalueof7.5.5406actinomycetesgrowthenvironmentalconditionssuitableforthetemperatureof35益，airrelativehumidityis60%orso，mattorlowlightconditions.5406actinomyceteswereculturedbyusingtheselectedculturemediumandenvironmentalconditions.Thegrowthrateofmyceliawasfast，thecolonywasthicker，thesurfacewasdense，andthegrowthwasgood.Keywords：5406actinomycetes；Highnumber1；Enrichedmedium；Diameterofthecolony

LILiYANGQianXINGliQINXiuli

（JilinAgricultureScienceandTechnologyCollege，Jilin，Jilin132101）

代谢过程中能够产生次级代谢抗菌素、生长素以及细胞分裂素等生物活性物质，能够刺激种子生根、发芽，对土著性病原菌具有较好的抑菌作用，减少种子受病害侵害，使土壤中无效磷、钾得到转化[1-2]。因此能促进作物生长，防止作物及果蔬枯萎病、白粉病等多种病害的发生，提高作物及果蔬的品质及产量

[3-4]

5406放线菌又称细黄放线菌（Actinomycesmicroflavus），在MgSO4·7H2O0.5g、FeSO40.01g、NaCl0.5g、琼脂18g、H2O1000mL、pH为7.2。1.1.3.2

10g葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等供试碳源至，配制供试高氏1号碳源加富培养基。

牛肉膏、蛋白胨、（NH4）配制供试高氏1号氮源2SO4等供试氮源，加富培养基。

维生素供试培养基：以高氏1号培养基为基础培养基，分别以高氏1号培养基为基础培养基，分别添加10g酵母浸粉、

供试培养基：以高氏1号培养基为基础培养基，分别添加

，是具有解钾、解

磷、抗病、促生、保苗等多功能的抗生菌肥[5-6]，在绿色农业生产中具有较好的应用前景。目前培养5406放线菌试管菌种常用高氏1号培养基，由于长期使用该培养基以及对其生长的环境条件不甚了解，在5406放线菌培养过程中常发生菌丝生长慢、甚至停止生长，杂菌污染严重问题等，针对这些问题本试验对培养5406放线菌常用的高氏1号加富培养基以及生长的环境条件进行研究，对高氏1号加富培养基配方及生长的环境条件进行了优化，为5406放线菌菌种培养及菌肥的生产提供理论依据。

素，配制供试高氏1号维生素加富培养基。1.1.4

主要设备及用具

添加0.2g维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12等供试维生

超净工作台（SW-CJ-2FD型，上海新苗医疗器械）；高压蒸汽

1.1

1材料与方法

材料

锅（MLS-3781L-CP型，松下医疗器械）；生化培养箱（HPS-280型，哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；智能培养箱（PGX-350A型）；电子天平（BSA224S-CW型，赛多利斯科学仪器）；游标卡尺；1.2

分析天平；移液枪等。

方法

供试菌种的活化

1.1.2

学院微生物实验室提供。

1.1.1菌种：5406放线菌试管菌种由吉林农业科技学院生物工程

FeSO4、NaCL、琼脂、NaOH、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生1.1.3.11.1.3

素B12均为分析纯。

培养基

菌种活化培养基：以高氏1号培养基为基础培养基及菌

蛋白胨、（NH4）KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、2S04、可溶性淀粉、

供试药剂：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、

1.2.1

5406放线菌母种中挑取少许菌丝及孢子，试管培养基上划线接1.2.2

致密的试管作为供试菌种，制备成104/mL孢子悬浮液。

高氏1号加富培养基（碳源、氮源、维生素）单因素试验

配制高氏1号基础试管培养基，在无菌条件下，用接种环从

种，27益恒温培养7天，选取菌落表面干燥、坚实多皱、菌丝洁白、

种活化培养基。其配方为可溶性淀粉20g、KNO33g、K2HPO40.5g、

作者简介：

李丽（1995-），女，本科生；就读于吉林农业科技学院生物工程学院应用生物科学专业。

通讯作者：秦秀丽，教授。主要从事微生物及食药用菌教学及科研工作。E-mail:qinxiuli88@126.com

项目来源：2017年吉林省大学生科技创新项目，项目号（2017025）。

长势以菌落直径源、维生素。1.2.3

0.1mL，每个因素接20个平板，在27益恒温培养7天，观测菌丝的

[7]

维生素制备平板培养基，每个平板中接104/mL孢子悬浮液

，确定高氏1号加富培养基中适宜的碳源、氮

在高氏1号基础培养基按1.1.3.2分别加入供试碳源、氮源、

根据1.2.2单因素试验结果，以筛选出的适宜碳源、氮源、维

只有合作，才会成功。吉林蔬菜杂志，圆您致富之梦！高氏1号加富培养基最适配方的确定

·39·

蔬菜科技服务新农村致富百姓生素、pH为试验因素，设计L（934

）

正交试验[8]（设计见表1），配制9种高氏1号加富培养基，每个试验组接20个平板。在27益恒温培养7天，观测菌丝的长势以菌落直径，确定高氏1号加富培养基

最佳组合。

表1

L9(34)营养液正交试验因素及水平

因素水平1A：麦芽糖（g）B:牛肉21.2.431052.0膏（g）C：VB0.1（1g）D5406放154.0线菌生长环境6.0O.26.5：pH条0.37.07.5号1.2.4.1加富培5406养基最放适线配菌方生长适宜制作平板温件培度的的单养基确因，定：按素试验

每个平照板优中化接出10的4子悬浮液0.1mL，分别放置于25益、30益、35益、40益、45益生/mL高氏化培孢

1

养箱中在无光条件下培养7天，每个水平接20个平板，观测菌丝的长势1.2.4.2

以菌落直径，确定5406放线菌生长的适宜的温度条氏1号加富5406培放养线基最菌生长适宜适配方光制照作条平件板的确定：按照优化出件的。高

板500Lx104/mL，观测条孢菌件子丝下悬的长势，浮在液最适0.1mL以温菌度，落下分直进别径行放，确培置定养于无54067天光培。、养100Lx基，放每线个菌水平、每200Lx个平生长的适宜的接、板20300Lx中接

个平

、

1.2.4.3光照条件的10高氏15406。

号加富放线培菌养生长适宜基最适配空方气制相对湿作平板度的培养确基定：，每按个照优化出

50%/mL孢子悬浮液0.1mL，分别放置于空气湿度为40%平板耀中接

4下进耀行60%培养、60%7天耀。70%每个、70%水平耀80%接20条个件平下板，在，观最测适菌温丝度的长势和光照50%以条菌件、落

2

直径结果，确定5406放线菌生长的适宜的光照条件2.1.1

2.1

高高氏与氏1分号加富析

。

培养基（71号碳源加富培碳养源基、的氮源筛选

、维生素）单因素试验结果66.35

55.18

5.46

4.54

433.62

葡萄糖

蔗糖

乳糖

麦芽糖

图15406放线菌在高氏1号不同碳源加富培养基上生长情况

试验结果见图1。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同的供试碳源5406放线菌菌丝生长速度的影响是不同的。从图1中可以看出5406放线菌在添加麦芽糖加富培养基上菌丝生长最快，接种7天后菌落直径达到6.35mm，比对照培养基上菌落直径大2.73mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在蔗糖和葡萄糖加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大1.84mm和1.56mm，菌落表面白色，较致密；以乳糖为碳源加富培养基上菌落生长速度最慢，接种7天后菌落直径达到4.54mm，比对照培养基上的菌落直径大0.92mm，菌落表面白色，较致密。因此，通过试验筛选出高氏1号碳源加富培养基为麦芽糖，其次为蔗糖和葡萄糖，生长最慢的为乳糖。

40·展示新形象，

创新发展！服务新农村，致富百姓！专家论坛2.1.2

高氏71号氮源加富培养基的筛选

66.16

5

5.22

5.17

43.62

3.863

牛肉膏

蛋白胨

酵母膏

（NH4）2SO4图25406放线菌在高氏1号不同氮源加富培养基上生长情况

试验结果见图2。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同供试氮源，对5406放线菌菌落生长速度的影响是不同的。从图2中可以看出5406放线菌在添加牛肉膏氮源加富培养基上菌丝生长最快，接种7天后菌落直径达到6.16mm，比对照培养基上菌落直径大2.54mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在蛋白胨和酵母膏氮源加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大1.60mm和1.55mm，菌落表面白色，较致密；在（NH4）2对照相近，接种7天后SO4氮源加富培养基上菌落生长速度最慢，与菌落直径达到3.86mm，只比对照培养基上的菌落直径大0.24mm。因此，通过试验筛选出高氏1号氮源加富培养基为牛肉膏，其次为蛋白胨和酵母膏药，而（NH4）2SO4氮源2.1.3

加富培养高基氏生长1号上维菌生落素生长加富最培慢养。

基的筛选

766.24

5.87

544.85

5.46

3

3.62

VB1VB2VB6VB12图35406放线菌在高氏1号不同维生素加富培养基上生长情况

试验结果见图3。试验结果表明，在高氏1号基础培养基中添加不同供试维生素，5406放线菌菌落生长速度的影响是不同的。从图3中可以看出，5406放线菌在添加VB1加富培养基上菌落生长最快，接种7天后菌落直径达到6.24mm，比对照培养基上菌落直VB径大2.62mm，观察菌落表面特征，菌丝呈白色，致密；其次是在12加富培养基上生长较快，菌落直径分别比对照培养基上菌落直径大2.25mm，在VB6加富培养基上菌落直径比对照培养基上菌落直径大1.84mm；在VB对照培养基上菌落直径大1.23mm2加富培养基上菌落生长速度最慢，比

；因此，通过试验筛选出高氏1号维生素加富培养基为VB1，其次为VB12，在VB2加富培养基生长上2.2

菌丝试验高生长氏结1最果号慢见加富。表培3。养由基最表3适可配知方，的不确同定

组合之间5406放线菌菌

落生长速度是不同的，以A3快，菌落的平均直径为6.64mmB2C1，菌D3组合放线菌菌落的生长速度最

落表面为白色，菌落表面致密，长势好。从极差分析结果可以看出，对5406放线菌生长速富培养基最适配方为可溶性淀粉20g、麦芽糖15g、牛肉1率膏号影响的排序为麦芽糖>pH>VB1>牛肉膏，通过试验确定高氏4g加

、

·专家论坛NaCLB120.1g0.5g、KNO、琼脂33g18g、K、2HHPO42O1000mL0.5g、、MgSOpH为4·7.57H。

2O0.5g、FeSO40.01g、

表3

L（934

）

正交试验结果序号A（：麦B:菌落平均（牛肉膏D：pH值21（g/L芽糖5））11g/L)（C:VB1312（2）1g/L)4.25mm直径43（（4）2（0.1）14.7452（110）16）3（（0.20.3）2（6222）3（6.5）（7.07.5）3）5.1973315.6583（215）1124.869323125.7836.166.64K13K214.1816.063K316.2916.2416.37214.2315.12R17.9216.0915.5116.68最优组合3.740.1815.8317.48B20.86C13.25D32.3.1

2.3

5406A35406放放线线菌菌生长生长适宜环境条温件度的的单确因定

素试验结果765.87

6.53

544.71

4.46

323.2420℃

30℃

35℃

40℃

45℃

图4不同温度对5406放线菌生长的影响

试验结果见图4。由图4可知，5406放线菌菌落随着温度的升高，生长速度逐渐加快，在35益下生长速度最快，培养7天菌落直径达6.35mm，菌落表面白色致密，长势好，当超过35益时，生长速3.24mm度逐渐，菌下落降表，当温丝度稀达疏到，长势45益差时。，培由此可养知7，天5406的菌放落线直菌径生长

为的适宜2.3.2

温5406度为放35面线益菌菌。

生长适宜空气相对湿度的确定

765.78

6.54

55.165.43

5.26

43

40%

50%

60%

70%

80%

图5不同空气相对湿度对5406放线菌生长的影响

试验结果见图5。由图5可知，5406放线菌菌落随着空气相对湿度的升高，生长速度逐渐加快，当空气相对湿度达到60%时，生长速度最快，培养7天菌落直径达6.54mm，菌落表面白色致密，长势好；当空气湿度超过60%时，菌落的生长速度逐渐下降，特别是空气湿度达到80%时，平板培养基污染较重，表明5406放2.3.3

线菌不宜在5406高湿条放线菌件生长的适宜下培养，最光适的照条空件气的相对湿度为60%左右。

试验结果见图6。由图6可知，5406放确线定

菌菌落在无光或弱吉林蔬菜展示新形象创新发展光条件生长速度较快，随着光照的增强，生长速度逐渐下降。观察菌落表面特征，在无光或弱光条件下菌落致密，较厚，长势好；当光照达到300Lx后，菌落薄，长势较差。

76.5666.32

5.78

55.35

4.82

43

100Lx

200Lx

300Lx

400Lx

图6不同光照强度对5406放线菌生长的影响

3

3.1

结在论高与氏讨1号论

糖作为单糖要比双碳糖源更加富容易培被养吸基收的，筛但选本试验研究中在中，从高理氏论上1号看基葡萄

础培养基中加入麦芽糖为速效碳源时，5406放线菌菌落生长速度最快，长势最好，说明麦芽糖更易于5406放线菌吸收利用；进行高氏54061号生长的放氮源较线快菌加富，吸长势好，收培和利用养基筛而在，特选时，试验结果证明有机氮源有利于高别氏是1牛号肉基膏础氮源培养加富基中培加养入基无，菌机落氮源

的NH4）2菌落的生长速度与对照相近，说明5406放线菌对无机氮源SO4时，吸收利用不充分；在高氏1号维生素加富培养基筛选试验中，添加不同的维生素时5406放线菌与对照相比较均有促进3.2

作用，培试验添加养基结VB（对果1表和照明VB）相比，所12时用效果最佳。

，均的能够高氏促进1号加富5406培放养线基菌与的生长，高氏1号但基通础

过

正交试验筛选出适合5406放线菌生长的高氏1号加富培养基配

方为可K溶性淀粉20g、麦芽糖15g、牛肉膏4g、B12HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO40.01g、NaCL0.5g0.1g、、琼KNO脂318g3g、H、

更2O3.3

充分1000mL，更有、利pH于为54067.5。该配方与高氏1号基础培养基相比，营养环境条5406件。放为线了菌确生长定5406不放仅线放需要菌的生长。线菌充足生长适宜的的营养条环境件，条还件需要，本适宜的

试验对温度、光照、空气相对湿度进行了单因素试验研究。试验结果表明，5406放线菌生长适宜的环境条件为适宜温度为35益，适宜的空气相对湿度为60%左右，在无光或弱光条件下生长快，菌落较厚，表面致密，长势好。

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