实验22过氧化物酶活性的测定 过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。 一、原理 在过氧化物酶(peroxidase)催化下,H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470m处有最大光吸收，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 马铃薯块茎。 (二)仪器设备 722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。 (三)试剂 (1)0.05 mol/L.pH5.的磷酸缓冲液。 (2)0.05 mo/L愈创木份溶液。 (3) 2%H202。 (4)20%三氯乙酸。 三、实验步骤 (一)酶液的制备 取5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转人离心管中,于3000g离心10 min,上清被转人25 mL,容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 (二)过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括:2.9 mL.0.05 mol/L磷酸缓冲液; 1.0ml.2%H2O2 ； 1.0mL.0.05mol/L愈创木面和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶成为对照，反应体系加人酶液后，立即于37C水浴中保温15min.然后迅速转人冰浴中，并加人2.0ml.20%三氯乙酸终止反应，然后，过虑(或5000xg离心10min),适当稀释.470mm波长下测定吸光度。 四、结果计算 以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。 过氧化物酶活性=∆𝐴470×𝑉𝑇𝑊×𝑉𝑠×0.01×𝑡[u/（g.min）] 式中:∆A470为反应时间内吸光度的变化 :W为马铃薯鲜重.g；t为反应时间，mins；VT为提取酶液总体积，ml；Vs为测定时取用酶液体积，mL。 实验24超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 （氮蓝四唑光化还原法） 一、原理 超氧物歧化酶(Superxide dismtae, SOD)普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离−子自由基(O−2的酶,它催化下列反应:2O2+2H+ H2O2+02反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生−−O−2, O2可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560m处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 水稻或小麦叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，高速台式离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管，荧光灯。 (三)试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮） （2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 （5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存。 三、实验步骤 酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5--2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。 显色反应 取试管（要求透明度好）4，2为样品测定管，2为对照管，按表39-1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置于暗处其他管于4000lx日光反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。 表39-1 各溶液加入量 试 剂（酶） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶 液 蒸馏水 总体积 用量(ml) 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 终浓度（比色时） 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 2支对照以缓冲液代替酶液 SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性： SOD总活性=(Ack−AE)×V0.5×𝑊×𝑉𝑡×𝐴𝑐𝑘 式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示； Ack为照光管的消光度值；AE为样品管的消光度值；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样鲜重，g。 苯酚法测定可溶性糖 一、原理 植物体内的可溶性糖是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛(分子式见蒽酮法)能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10- 100 mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485m波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定吸光度。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160 min以上。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 新鲜的植物叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。 (三)试剂 (1) 90%苯酚溶液：取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。 (2) 9%苯酚溶液。取3 ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30 ml,现配现用。 (3)浓硫酸(比重1.84)。 (4) 1%蔗糖标准液。将分析纯蔗糖在80 C下烘至恒重，精确称取1.000g加少量水溶解,转人100 mL容量瓶中，加人0.5 m浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线。 (5) 100 ug/蔗糖标准液。精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。 三、实验步骤 1.标准曲线的制作 取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表2-32-3加人溶液和水。 表2-32-3 苯酚法测可溶性糖绘制标准曲线的试剂量 管号 试剂 0 100ug.L-1蔗糖液/mL 0 1、2 0.2 3、4 0.4 5、6 0.6 7、8 0.8 9、10 1.0 水/mL 蔗糖量/ug 2.0 0 1.8 20 1.6 40 1.4 60 1.2 80 1.0 100 然后按顺序向试管内加人1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5—20s加人5 mL浓硫酸,摇匀。比色液总体积为8mL,在室温下放置30min,比色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定吸光度，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线,求出标准曲线方程。 2.可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10-0.30g,共3份(或干材料)，分别放人3支刻度试管中，加入5-10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min(提取2次)，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。 3.测定 吸0.5ml 样品液于试管中(重复2次)，加蒸馏水1.5mL，步聚与制作标准曲线相同，按顺序分别加人苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定吸光度。由标准曲线查出糖的含量。 四、结果计算 按下式计算测试样品的糖含量 从标准曲线查的糖的含量可溶性糖含量= 测定用样品液的体积106×样品重量×提取液体积×稀释倍数×100% 实验53脯氨酸含量的测定 在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸(proline,Pro)的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸,因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。 一、原理 当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出(或用同归方程计 算）脯氨酸的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 (--)材料 待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆等)叶片。 (二)仪器设备 分光光度计，研体，小烧杯，容量瓶，大试管，普通试管，移液管，注射器，水浴锅，漏斗，漏斗架,滤纸，剪刀。 (三)试剂 (1)酸性茚三酮溶液:将1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20ml 6mol/L磷酸中.搅拌加热(70℃)溶解，贮于冰箱中。 (2)3%磺基水杨酸:3g磺基水杨酸加蒸馏水溶剂解后定容至100mL (3)冰醋酸。 (4)甲苯。 三、实验步骤 1.标准曲线的绘制 (1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒人小烧杯内,用少量蒸馏水溶解，然后倒人250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。 (2)系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 ug/mL、2 ug/mL、3 ug/mL、4 ug/mL、5 ug/mL及6ug/mL。 (3)取6支试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮溶液,每管在沸水浴中加热30 min。 (4)冷却后各试管准确加人4mL甲苯，探荡30s,前置片刻，使包素全部转至甲苯溶液。 (5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。 (6)标准曲线的绘制:先求出吸光度值(y)依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL)。 2.样品的测定 (1)脯氨酸的提取:准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g,分别置大管中，然后向各管分别加人5mL3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常播动),冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。 (2)吸取2mL提取液于另一干净的带玻塞试管中，加人2mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮试剂，在佛水浴中加热30 min,溶液即呈红色。 (3)冷却后加人4 mL甲苯,摇荡30s，静置片刻，取上层液至10 mL离心管中，在3000 r/min下离心5 min。 (4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色,求得吸光度值。 四、结果计算 根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出)2 mL测定液中脯氨酸的含量(ug/mL),然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下: 单位鲜重样品的脯氨酸含量=5×x2106×样重×100% 实验8-12丙二醛的测定 [实验原理] 植物器官在逆境条件下或衰老时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是其产物之一,通常将其作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。 在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的3，5，5-三甲基噁唑-2，4-二酮，在532nm处有最大吸收波长。但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532 am处也有吸收，但其最大吸收波长在450 nm处。 植物在经受逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定中需排除可溶性糖的干扰，通常加人低浓度Fe+ (使其终浓度为0.5 nmol/L.植物组织中铁的含量一般为100~300 ug/g干重)，以显著增加TBA与糖的显色反应产物在450 am处的吸收。 采用双组分分光光度法可分别求出MDA和可溶性糖的含量。该法针对混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算出一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。 [器材与试剂] 1. 实验仪器 分光光度计，离心机，研磨器，恒温水浴锅，具塞试管。 2. 实验试剂 三氯乙酸，石英砂， 硫代巴比妥酸(TBA)溶液(用10% TCA配制0.6%的TBA溶液)。 3. 实验材料 盆栽小麦。 [实验步骤] 1.MDA的提取 盆栽小麦在抽德期停止浇水，进行干旱处理，取叶片1g将其剪碎，加入10%三氯乙酸(TCA)2mL和少量石英砂，研磨；进一步加人8mL TCA充分研磨，匀浆液以4000g离心10 min,上清液即为样品提取液。 2.显色反应及测定 吸取2mL提取液，加人2mL0.6% TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定332mm和450 nm处的OD值。对照管以2ml水代替提取液。 3.计算 MDA与TBA反应产物的最大吸收峰在532 nm.TBA与可溶性糖(以蔗糖为例）的反应产物的最大吸收峰在450nm吸收曲线彼此又有重叠。得到方程： 𝐶2=6.45×10−6×𝐴532−0.56×10−6×𝐴450 根据公式即可计算样品提取液中MDA的含量，然后再计算每克样品中MDA的含量。 实验3-3叶绿素a、叶绿素b含量测定 【实验原理】 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert -Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对OD值的影响，最后分别得到两种组分的含量。 叶绿素a的最大吸收峰在663 nm,叶绿素b在645 nm,吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert -Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的质量浓度ρ与光密度OD(A)之间有如下的关系: ρ𝑎=12.7𝐴663−2.69𝐴645 ρ𝑏=22.9𝐴645−4.68𝐴663 ρ𝑇=ρ𝑎+ρ𝑏=8.02𝐴663+20.21𝐴645 式中ρ𝑇为总叶绿素质量浓度，单位是mg/L。利用上面公式，即可计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的质量浓度(mg/L)。 【器材与试剂】 1.实验仪器 高级型分光光度计 ，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管。 2.实验试剂 丙酮, CaCO3。 3. 实验材料 植物叶片。 【实验步骤】 1. 色素的提取 取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放人研钵中加纯丙酮5 mL，少许CaCO和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5mL,将匀浆转人离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，并转入离心管,离心后弃沉淀， 上清液用80%丙酮定容至20 mL。 2. 测定OD值 取上述色素提取液1 mL,加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663 nm、645 nm处的OD值。 3.计算 按公式分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。 【注意事项】 1.由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。 2.由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 （1）试剂配制： 0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 61.0 mL和B母液(NaH2PO4) 39.0 mL混合后至100mL。(加1gPVP) （2）反应液配制：吸取5.68mL30%的H2O2（原液）稀释至1000mL，摇匀即可。 （3）样品测定： 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将容量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用. 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷却之后加入H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管号 S1 S2 S3 粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液（pH=7.8） 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240×Vt/0.1×V1×t×FW 式中 A240 = AS0－ （AS1+AS2）/2；AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 植物抗逆性的测定(电导仪法) 一、原理 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，组胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后,细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞侵提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。 二、材料、仪器设备及试剂 (-)材料 小麦、女贞叶片。 (二)仪器设备 电导仪，天平，温箱，真空干燥器，抽气机，恒温水浴锅，注射器。 (三)试剂 NaCl溶液。 三、实验步骤 (1)制作标准曲线:如需定量测定透性变化。可用纯Nacl配成0、10ug/ml、20 ug/ml 、40 ug/mL 、60 ug/mL、 80 ug/mL、100ug/mL的标准液，在20-25C恒温下用电导仪测定，可读出电导度。 (2)选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取两份。各重2g。 (3) 一份插人小杯中放在40C恒温箱内萎蔫0.5-1h，另一 份插人水杯中放在室温下做对照，处理后分别用蒸馏水冲洗两次，并用洁净过纸吸干，然后剪成长约lcm小段放人小玻杯中(大小以能够容纳电极为度)，并用玻璃棒或干净尼龙网压住,在杯中准确加人蒸馏水20mL,侵没叶片。 (4)放人真空干燥器， 用抽气机抽气7-8 min以抽出细胞间隙中的空气。重新缓缓放人空气，水即被压入组织中使叶下沉。 (5)将抽过气的小装杯取出，放在实验桌上静置 20min,然后用玻璃棒轻轻展动叶片，在20-25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。 (6)测过电导率之后，再放人 100℃沸水中15min.以杀死植物组织，放人自来水冷却10min,在20- 25℃恒温下测其煮沸电导率。 四、实验结果及分析 伤害率可以用下列三种形式表示： (1)伤害率=(2)伤害率=(3)伤害率=处理电导率−对照电导率煮沸电导率−对照电导率处理电导率煮沸电导率处理电导率对照电导率×100% ×100% ×100% 试比较不同处理(萎蔫处理与对照)的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。