有效磷的测定(Olsen法)

（pH 8.5 0.5molL-1NaHCO3 浸提—钼锑抗比色法）

一、实验目的及说明 土壤中有效磷的含量，随土壤类型、气候、施肥水平、灌溉、耕作栽培措施等条件的不同而异。通过土壤有效磷的测定，有助于了解近期内土壤供应磷的情况，为合理施用磷肥及提高磷肥利用率提供依据。 土壤速效磷的测定中，浸提剂的选择主要是根据土壤的类型和性质测定。浸提剂是否适用，必须通过田间试验来验证。浸提剂的种类很多，近20年各国渐趋于使用少数几种浸提剂，以利于测定结果的比较和交流。我国目前使用最广学的浸提剂是0.5molL-1NaHCO3溶液（Olsen法），测定结果与作物反应有良好的相关性[1]，适用于石灰性土壤、中性土壤及酸性水稻土。此外还使用0.03molL-1NH4F-0.025molL-1HCl溶液（Black法）为浸提剂，适用于酸性土壤和中性土壤。 同一土壤用不同的方法测得的有效磷含量可以有很大差异，即使用同一浸提剂，而浸提时的土液比、温度、时间、振荡方式和强度等条件的变化，对测定结果也会产生很大的影响。所以有效磷含量只是一个相对的指标。只有用同一方法，在严格控制的相同条件下，测得的结果才有相对比较的意义。在报告有效磷测定的结果时，必须同时说明所使用的测定方法。

二、方法原理 石灰性土壤中磷主要以Ca-P（磷酸钙盐）的形态存在。中性土壤Ca-P、Al-P（磷酸铝盐）、Fe-P（磷酸铁盐）都占有一定的比例。0.5molL-1NaHCO3（pH8.5）可以抑制Ca2+的活性，使某些活性更大的与Ca结合的P浸提出来；同时，也可使比较活性的Fe-P和Al-P起水解作用而被浸出。浸出液中磷的浓度很低，须用灵敏的钼蓝比色法测定，其原理详见土壤全磷的测定章节。 当土样含有机质较多时，会使浸出液颜色变深而影响吸光度，或在显色出现浑浊而干扰测定，此时可在浸提排荡后过滤前，向土壤悬液中加入活性碳脱色，或在分光光度计800nm波长处测定以消除干扰。

三、实验仪器

研钵、20目筛子、电子天平（0.0001）、振荡器、722分光光度计、振荡器、勺子、小烧杯、容量瓶

四、试剂配制 （1）0.5mol·L-1NaHCO3(pH8.5)浸提剂 42.0gNaHCO3（0.5mol 化学纯）溶于约800ml水中，稀释至1L，用浓NaOH调节至pH8.5（用pH计测定），贮于聚乙稀瓶或玻璃瓶中，用塞塞紧。该溶液久置因失去CO2而使pH升高，所以如贮存期超过20天，在使用前必须检查并校准pH值。 （2）无磷的活性碳粉和滤纸 须做空白试验，证明无磷存在。如含磷较多，须先用2mol·L-1HCl浸泡过液，用水冲洗多次后再用0.5mol·L-1NaHCO3浸泡过液，在布氏漏斗上抽滤，用水冲洗几次，最后用蒸馏水淋洗三次，烘干备用。如含磷较少，则直接用0.5mol·L-1 NaHCO3处理。 （3）钼锑抗试剂（6.5mol·L-1[H+]） 20.0g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]（分析纯）溶于300ml约60℃的水中，冷却。另取180ml浓H2SO4（分析纯）慢慢注入约400ml水中，

搅匀，冷却。然后将稀H2SO4液入钼酸铵溶液中，随时搅匀，再加入100ml 0.5% (m/v)酒石1酸氧锑钾[K(SbO) C4H4O6·H2O]溶液；最后用水稀释至1升，盛于棕色瓶中，此为钼锑贮

2备液。 临用前（当天）称取0.50g抗坏血酸（分析纯）溶于100ml钼锑贮备液中，此为钼锑抗试剂，在室温下有效期为24h，在2~8℃冰箱中可贮存7天。 （4）磷标准储备液（Cp = 500g·L-1） 准确称取45℃烘干4~8h的KH2PO（4分析纯）2.1968g溶于烧杯中加100ml水溶解，缓加入5ml浓H2SO4（分析纯），再全部转入1L容量瓶中，用水定容，该贮备液可长期保存。 （5）磷标准工作液（Cp = 25g·L-1） 准确吸取磷标准储备液50ml于1L容量瓶中，加入30ml 3mol·L-1H2SO4，用水稀释至刻度定容摇匀，此为25磷标准液；用前再准确稀释至2.5g·L-1,以此液配制磷标准溶液系列。

五、操作步骤 （1）称取风干土样2.00g置于干燥的250ml三角瓶中，加入0.5mol·L-1NaHCO3浸提剂40ml，加1平勺无磷活性碳，于往复振荡机上振荡301min，温度设计为25℃。立即用无磷干滤纸过滤到干燥的50ml烧杯瓶中。 （2）在浸提土样的当天，吸取滤出液5.00ml放入干燥的25ml容量瓶中，加2,4-二硝基酚2~3滴，此时溶液显黄色。用3或6mol·L-1H2SO4、0.5mol·L-1H2SO4、1mol·L-1NaOH调色至刚好无色为止。再加入2.5ml钼锑抗显色剂，慢慢摇动，使CO2逸出。再加入蒸馏水定容，充分摇匀，显色30min。用1cm光径比色管在700nm波长处测读吸光度，以空白溶液（5.00ml 0.5mol·L-1NaHCO3溶液代替土壤滤出液，同上处理）为参比液，调节分光光度计的零点。 （3）校准曲线 在测定土样的同时，准确吸取2.5g·L-1磷标准工作溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，分别放入25ml容量瓶中，加水5~10ml, 再加2,4-二硝基酚指示剂2~3滴，用H2SO4及NaOH调节酸度至刚好无色或浅黄色。再加钼锑抗试剂2.5ml，定容至刻度，摇匀显色，即得磷标液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1。然后同待测液一样进行比色，绘成标准曲线。

六、结果计算 土壤有效磷（P），mg·kg-1 = 显色液Cp *显色液体积*分取倍数/ 土样质量

式中 Cp——从校准曲求得土壤滤出液中磷的浓度，mg·L-1P 显色液体积------25ml 注释： （1）用0.5mol·L-1NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定结果的评价标准如下：

土壤有效P(mg·kg-1) < 5 5~10 > 10 土壤有效P供应标准 低（缺磷） 中等（边缘值） 高（不缺磷）

七、数据处理

1、标准曲线 曲线浓度（mg/L） 吸光度 0 0.000 0.10 0.004 0.20 0.076 0.40 0.199 0.60 0.298 0.80 0.392

绘制标准曲线：

得出公式：y=1.9575x+0.0198

2、样品数据 组别 吸光度 实际吸光度 空白 0.003 0 样品1 0.031 0.028 样品2 0.034 0.031 样品3 0.040 0.037 样品4 0.037 0.034 显色液Cp，mg·L-1=y=（吸光度-空白）*05031-0.0082

土壤有效磷P，mg·kg-1 = 显色液Cp *显色液体积*分取倍数/ 土样质量

代入数据得显色液Cp，mg·L-1： 样品1：y = 0.075mg/L 样品2：y = 0.080mg/L 样品3：y = 0.092mg/L 样品4：y = 0.086mg/L

各样品土壤有效磷（P）含量为：

样品1 P1 = 0.075 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏ =7.46 mg/㎏ 样品2 P2 = 0.080 * 25* （40 / 5）/ 2 mg/㎏ =8.05mg/㎏ 样品3 P3 = 0.092 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏ =9.22mg/㎏ 样品4 P4 = 0..086 * 25 * （40 / 5）/ 2 mg/㎏ =8.64mg/㎏

八、结果分析

（1）从实验的结果来看，四个重复样品的有效磷值相互间有点偏差，造成的原因有多种： 第一，有可能是吸取滤出液时取出的量有误差，不完全相等，造成偏差； 第二，有可能是定容50ml时，定容不准确造成偏差；

第三，有可能是测量时润洗比色皿，没有润洗干净，造成偏差； 第四，可能是分光光度计测量不准确，造成的偏差；

但从最终结果来看， d = [|6.70 - 8.05| + |7.90 - 8.05| + |9.10 - 8.05| + |8.50 - 8.05| ] / 4 =0.75 dr = 0.75 / 8.05 * 100% = 9.31%

结果的相对平均偏差较大，因此所测的结果不足以作为土样的有效磷值。

（2）根据用0.5molL-1NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定结果的评价标准，所测得的结果（土壤有效磷）处于5~10mg/Kg之间，因此土壤的有效磷处于中等标准（边缘值）。 假如所测的结果为准确值，则所测的土样的有效磷量少，不利于磷的种植、生长。