甲醛法测大豆蛋白水解度的改进

徐

摘

要

勤

葛向阳

刘建峰

建立了一种适于豆粕固态发酵中大豆蛋白水解度测定的新方法。以脱脂豆粕为原料，

以产蛋白酶的微生物为生产菌种进行豆粕固态发酵。微生物所产蛋白酶作用于豆粕中的大豆蛋白，将其水解成大豆多肽。通过新建立的方法测定不同发酵时间大豆蛋白的水解度，并与文献所报道的常规测定方法进行比较。结果表明，新建立的水解度直接测定法快速、简便、灵敏度高、可重复性强，不仅适于微生物固态发酵法蛋白质水解度的测定，还普遍适用于其它蛋白水解度的测定。

关键词

甲醛法；水解度；蛋白水解；微生物发酵

中图分类号

Ｓ８１６．１７

中产生蛋白酶水解大豆蛋白。

大豆多肽即大豆蛋白水解物的总称，是大豆蛋白质经蛋白酶水解而制成的多种低分子肽混合物，通常由３～６个氨基酸组成，其分子量主要分布在１０００Ｄａ左右。因其具有大豆蛋白不可比拟的优越加工特性和特殊的生理活性，而被广泛研究。因此在生产中，反映原料蛋白被水解程度的指标———水解度（ＤＨ，Ｄｅｇｒｅｅｏｆ

１．２主要试剂

３７％的中性甲醛溶液；ＮａＯＨ标准溶液０．１ｍｏｌ／ｌ；

其它试剂都为分析纯。

１．３主要仪器设备

ＢＳ２００电子天平；磁力搅拌器；８１８型ｐＨ计；ＫＤＮ—４Ｂ凯氏定氮仪。２２．１２．１．１

方法

水解度测定法的建立原理

蛋白质或多肽水解时每断裂一个肽键（酰胺键），同时释放出一个游离—ＮＨ２和一个游离—ＣＯＯＨ。因水溶液中的蛋白质或多肽为兼性离子，所以不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的—Ｎ＋Ｈ３结合，形成—ＮＨ—ＣＨ２ＯＨ、—Ｎ（ＣＨ２—ＯＨ）２等羟甲基衍生物，使—Ｎ＋Ｈ３上的Ｈ＋游离出来，这样就可以用碱滴定－Ｎ＋Ｈ３放出Ｈ＋，测出氨基氮，从而计算水解度。

Ｈｙｄｒｌｙｓｉｓ），其及时测定便成为保证产品质量的关键。

水解度通常的定义为：

被水解的肽键数

）×１００％

原料中的总肽键数

ＤＨ＝（

常见的蛋白质水解度的测定方法有甲醛法、茚三酮法、三硝基苯磺酸法（ＴＮＢＳ）、ｐＨ－ＳＴＡＴ法和三氯乙酸法。在上述几种方法中，ＴＮＢＳ法测定结果相对可靠，但测定用试剂不容易买到；ｐＨ－ＳＴＡＴ法需要特别的仪器，普通的实验室一般没有这一整套设备；三氯乙酸法操作耗时长，且结果偏高较多。国内通常采用甲醛法和茚三酮法。对于茚三酮法，由于比色测定时读数不稳定，很难读出一个准确的数值，而且它采用单一氨基酸作为标准，而不同的氨基酸对茚三酮的显色度有偏差，因此所得的结果不够准确。甲醛法操作相对简单，但结果偏低。本文介绍一种实用、简便的甲醛变通法。

２．１．２２．１．２．１

过程

豆粕完全水解液的制备

称取１５ｇ豆粕放入烧杯中，加入６ｍｏｌ／ｌＨＣｌ１５０

ｍｌ，密封后放入１１０￣１２０℃的烘箱中水解２４ｈ。取出

过滤，用蒸馏水定容１５０ｍｌ，吸取１０ｍｌ，再加入２０ｍｌ蒸馏水，用４０％和２％的ＮａＯＨ调ｐＨ值到８．２。

１１．１

材料试验材料

豆粕粉：市购低温脱脂豆粕。

发酵菌种：实验室保藏菌种，此菌能在发酵过程

２．１．２．２发酵酶解样品水解液的制备

称取２０００ｇ样品（是固体发酵豆粕），加入６０ｍｌ蒸馏水，用２％的ＮａＯＨ调整ｐＨ值到８．２，振荡３０

ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液３０ｍｌ。

徐勤，湖北轻工职业技术学院轻化系生化工程教研室，

２．１．２．３发酵样品水解度的测定

４３００７０，武汉市武昌区石牌岭东二路。

葛向阳、刘建峰，单位及通讯地址同第一作者。收稿日期：２００７－０１－１４

用０．１ｍｏｌ／ｌ的ＮａＯＨ溶液滴定水解液到ｐＨ＝

８．２，加入１０ｍｌ３７％的甲醛溶液（所用甲醛溶液先用ＮａＯＨ滴定到ｐＨ值８．２），再用０．１ｍｏｌ／ｌ的ＮａＯＨ滴

４６

徐勤等：甲醛法测大豆蛋白水解度的改进检测技术次为０．００％，第三次为０．０８％，远远低于ＧＢ／Ｔ５００９．１２４—

定到ｐＨ值８．２。记录加入甲醛后把溶液滴定到ｐＨ＝８．２所耗碱量。同时用蒸馏水代替样品水解液重复上述步骤，作为空白对照。

２００３中规定的１２％的相对误差标准。因此本方法的

稳定性非常可靠。

２．１．３计算公式

样品的耗碱量

－原料的耗碱量

样品的蛋白含量原料的蛋白含量

ＤＨ＝

完全水解液的耗碱量

－原料的耗碱量

完全水解液的蛋白含量原料的蛋白含量３．２测定方法的验证性试验

检测三种不同蛋白含量的豆粕样品，比较凯氏定

氮值和本方法倒推值之间的差值，具体见表２。

表２

测定方法的验证性试验（％）

１

４２．３１４１．８７０．４４

２４５．５６４５．１９０．３７

３４７．６８４７．１２０．３６

×１００％

注：公式中的样品指发酵酶解样品，其制备方法见２．１．２．２；原料指

发酵前的豆粕原料。

２．１．４水解度测定方法的验证

根据水解度测定的原理，取２．１．２．１中的完全水解

不同豆粕样品

凯氏定氮值（蛋白含量）本方法倒推值（蛋白含量）两者差值

从表２可以看出，本方法倒推值比凯氏定氮值偏低，这和甲醛法测定值偏低的文献报道基本一致，但凯氏定氮值和本方法倒推值之间的差值都在０．５０以下，完全可以满足工业生产测定的准确度要求，因此证明了本方法的正确性和合理性。

液１０ｍｌ，根据本方法测定出每克样品蛋白中的完全水解液的耗碱量（Ｖ１），然后根据下面的公式，计算每克样品中的氮含量或蛋白质含量，并与凯氏定氮法测定的结果相比较，看两者的差别。

（）Ｃ×０．０１４０１×Ｗ＝Ｖ１－Ｖ２×１００％

１００－ＷＨ２０ｍ×１００式中：Ｗ———氮含量，％；

——测定时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体Ｖ１—积，ｍｌ；

——空白试验消耗氢氧化钠标准滴定溶液的Ｖ２—体积，ｍｌ；

——氢氧化钠标准滴定溶液实际浓度，ｍｏｌ／ｌ；Ｃ———试样的质量，ｇ；ｍ———试样中水的含量，％；ＷＨ２０———与１．００ｍｌ氢氧化钠标准滴定溶液０．０１４０１—［ＣＮａＯＨ＝１０００ｍｏｌ／ｌ］相当的以克表示

的氮的质量。

４结论

本方法是豆粕固态发酵中蛋白质水解度的直接

测定方法，从原理上符合肽键被水解的规律，计算公式上反映了水解度的定义。本方法和传统的甲醛法相比，测定结果仍然偏低，这是由于甲醛法的固有特性决定的。改进的甲醛法由于改进了样品的处理过程，主要包括ｐＨ值的调节和稀释倍数的调整确定等，使其对产品的处理过程更符合水解度定义的内涵，从而在后面的滴定中，缩短了滴定的时间，减少了对精密

ｐＨ计电极的损坏。因而能快速检测发酵豆粕的水解

度，且操作简单，是一种非常好的，能被迅速推广的可靠的方法。

本方法仅在蛋白原料彻底酸水解一步需２４ｈ，一旦此数据已得，便可用于以此原料为底物的任何产品水解度的测定计算。目前已被推荐到发酵豆粕的生产单位和购买单位，反映良好。

参考文献

［１］余勃，陆兆新．微生物发酵法产大豆多肽液水解度的测定［Ｊ］．食品

科学，２００５，２６（４）：１０４－１０７．

２．２蛋白质含量的测定方法

蛋白质含量的测定采用ＧＢ／Ｔ５００９．５—２００３食品

中蛋白质的测定。

３

３．１

结果与讨论

测定方法的稳定性试验

检测三次同批的发酵样品，每次各五个重复，所

［２］袁斌，吕桂善，刘小玲．蛋白质水解度的简易测定方法［Ｊ］．广西农业生物科学，２００２，２１（２）：１１３－１１５．

测得的水解度值见表１。

表１

项目第一次

第二次第三次总平均值

测定方法稳定性试验（％）

五个重复

平均值相对误差

（６）：１７６－１７７．［３］郭兴凤．蛋白质水解度的测定［Ｊ］．中国油脂，２０００，２５

［４］何照范，张迪清．保健食品化学及其检测技术［Ｍ］．中国轻工业出版社，１９９８．１４１－１４２．

１２３４５

１２．９２１３．０２１３．００１３．１６１２．９４１３．１４１３．０６１２．８５１３．０６１３．０３１３．０１１３．１０１３．０８１３．０２１２．９８

１３．０１１３．０３１３．０４１３．０３

０．１５０．０００．０８

［５］赵新淮，冯志彪．大豆蛋白水解物水解度测定的研究［Ｊ］．东北农业

大学学报，１９９５，２６（２）：１７８－１８１．

［６］赵新淮，冯志彪．蛋白质水解物水解度的测定［Ｊ］．食品科学，１９９４，

１５（１１）：６５－６７．

由表１可知，第一次的相对误差为０．１５％，第二（编辑：张学智，ｍｅｎｇｚａｉ００７＠１６３．ｃｏｍ）

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