分子生物学技术在植物营养学研究中的应用_综述_

分子生物学技术在植物营养学研究中的应用(综述)

张　勇　米国华　张福锁

(中国农业大学农业部植物营养学重点开放实验室,北京　100094)

摘　要:　随着植物营养学研究的发展,越来越多的分子生物学技术用来解决植物营养学问题并取得初步的成果。本文重点对分子标记技术和基因克隆技术在此方面的应用作以综述。

关键词:　分子标记;基因克隆;植物营养性状;转运蛋白

DNA双螺旋模型和中心法则的提出,明确了遗传信息传递的规律,从而使分子生物学有了迅猛的发展,逐渐成为生命科学中最具活力的学科。分子生物学与其它学科的结合及分子生物学技术的广泛应用,不仅拓宽了研究领域,而且使我们对分子水平上生命现象和生物学规律的认识更加深入。分子生物学技术包括分子克隆、细胞融合、杂交瘤技术、突变体筛选等多种,本文仅介绍目前较多应用于植物营养学研究中的几种分子标记技术和基因分离技术。

1　分子遗传标记技术及其在植物营养学研究中的应用

遗传标记技术的发展自十九世纪中期产生,经历了形态学标记、细胞学标记两个阶段。1991年Orodzicker等第一次利用DNA限制性片段长度多态性(RestictiveFragmentLengthPolymorphism,RFLP)进行腺病毒血清型突变体基因组作图,使遗传标记技术最终突破表达基因的范围而进入分子水平,并随之发展了AFLP、RAPD、SSLP、STS等一系列分子标记技术。这些技术为遗传图谱构建,及建立在此基础上的基因克隆、辅助选择提供了重要手段。

RFLP是不同物种、品种甚至个体间DNA经核酸限制性内切酶酶切后产生的片段长度差异,通过同源序列的探针检测到,实质上是DNA分子中核苷酸序列不同的反映。目前,已利用RFLP标记在番茄、小麦等多种高等植物构建了高密度遗传图谱,RFLP标记技术也广泛应用于与植物营养性状有关基因的研究。如在植物抗盐性研究中,应用此技术进行数量性状位点QTL(QuantitativeTraitLoci)定位,并测定其单个基因对抗盐性的贡献,从而为鉴定、了解、甚至操纵象高等植物抗盐性这样复杂性状的QTL奠定了基础。Foolad(1997)应用RFLP标记对番茄萌发过程中影响盐抗性的基因组区域进行了研究发现位于7条染色体上的8个区段与盐抗性密切相关。Reiter(1991)[2]发现5个RFLP标记座位与玉米磷效率性状显著相关。Riede(1996)[3]亦应用该技术分析了与小麦抗铝性有关基因的数目及其在染色体上的位置,发现小麦抗铝主效基因位于4DL染色体臂上,与两个RFLP标记XBCD1230及XCDO1395紧密连锁。此外,Lin和Cianzio(1997)[4]还将RFLP技术用于研究大豆中控制缺铁黄化基因的遗传机制。这些工作不仅是进行种质评价中重要一环,也是通过染色体步行法(ChromosomeWalking)克隆相关基因的起点。

随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技术是1990年由Willams和Welsh几乎同时发展起来的,它基于PCR(PolymeraseChainReaction)技术,以一系列随机引物对目标基因进行扩增,电泳分离检测其产物多态性,进而得知基因组相应区段的多态性。此技术有反应灵敏、操作简单迅速、需DNA量少等优点,虽存在反应结果不易重复、多态性低等不足,但随着其不断改进和完善,此技术亦有较广阔的应用前景。Ling[5]等(1996)以两个番茄突变体为材料,利用RAPD分子标记及高密度的RFLP图谱,定位了2个与铁代谢调控有关的基因chln和fer,其

　张　勇:27岁,硕士研究生,研究方向硝酸盐转运蛋白基因的分离及氮素代谢生理生化收稿日期:1998-04-03[1]

第4期张勇等:分子生物学技术在植物营养学研究中的应用(综述)

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中chln与非蛋白氨基酸烟酰胺(NA)的合成有关,fer则与启动机理I缺铁反应有关。他们已开始着手通过染色体步行法分离fer基因。

　　扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)技术也是基于PCR技术的限制性片段长度多态分析(PCR-basedRFLP)。具体步骤是将基因组DNA用一组限制性内切酶(EcoRⅠ和MseⅠ)消化,将所得片段连到带相应序列的接头(Adaptors)上,再用一定的随机引物进行扩增,引物包含接头的特定序列及1～3个随机核苷酸组合成的选择性序列,最后用凝胶电泳观察产物多态性。此方法特点是出现多态性的频率较高。Sharma(1996)[6]将AFLP技术用于对扁豆多样性和系统发育的分析并与RAPD方法进行了比较,得出的AFLP与RAPD比较,可检出更多的多态性且作为分子标记更有效。Pakniyat(1997)[7]比较了39个野生大麦品种在盐胁迫下的AFLP差异,发现有12个AFLP标记与大麦地上部钠含量有密切关系,其中3个标记可以解释60%的地上部钠含量的差异来源。证明AFLP指纹可有效的应用于对野生种群复杂性状的研究。

2　基因分离技术

植物的营养性状归根结底都是由基因控制的,这就决定了目地基因的分离不仅是在分子水平进行植物营养研究的入手点,同时也是通过基因工程进行性状考察的关键。

分离目地基因,一般需要构建基因文库(Genelibrary),即由大量不同外源DNA片段所构成的重组DNA群体。根据其重组体外源DNA片段来源不同,基因文库分为基因组文库(GenomicLibrary)和cDNA文库(cDNALibrary),前者来源于某一生物的基因组DNA,后者由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录成cDNA构成。

cDNA文库可分表达型和非表达型两类,表达型cDNA文库采用表达型载体,插入的cDNA片段可表达产生融合蛋白,具抗原性或生物活性,适用于那些蛋白质的氨基酸序列尚不清楚,不能用核苷酸探针筛选的目地基因。非表达型cDNA库适用于那些可采用核苷酸探针进行杂交筛选的基因。即利用同种或同属的已知同源序列,或由部分蛋白质序列推知的人工合成的寡核苷酸序列,经放射性标记后做探针,通过菌落原位分子杂交法与cDNA库杂交,放射自显影判断与探针序列同源的目的基因所在菌落,从而分离目的基因。非表达型cDNA文库的构建在植物营养性状有关基因分离中得到了广泛的应用。Lauter(1996)[8]利用拟南芥(Arabidopsis)硝酸盐与铵盐转运蛋白基因AtNrt1和AtAmt1作异源探针,从番茄根毛cDNA文库中分离出两个相应的硝酸盐转运蛋白基因LeNrt1-1、LeNrt1-2和一个铵盐转运蛋白基因LeAmt1。Trueman(1996)[9]等人利用一系列已克隆的硝酸盐转运蛋白基因的同源保守序列合成探针并与大麦根cDNA文库进行杂交,克隆出两个编码高亲和力硝酸盐转运蛋白的片段pBCH1与pBCH2。接着,Quesada(1997)

[10]

等又根据相似技术路线从烟草cD-

NA库中分离出硝酸盐转运蛋白基因片段Nrt2。

如果尚不具备合适的探针,则常通过差别筛选(DifferentialScreening)亦称差别杂交(Differen-tialHybridization)法分离基因。具体原理是:设有两种表型细胞,用表达特异的组织(+)中提取的(+)mRNA构建cDNA文库,再分别用(+)组织与(-)组织中提取的mRNA制成广泛的cDNA探针,与文库菌落或噬菌斑作原位杂交,选出只与(+)探针杂交而不与(-)探针。杂交的克隆,即可能为特异表达的目的基因(图1)。Mori(1993)[11～13]即是通过差别筛选法对大麦铁胁迫特异基因进行筛选,得到7个特异杂交的克隆,并对其中3个进行了测序,分别定名为Ids1、Ids2、Ids3。利用该种方法,Snowden(1993)克隆了小麦根系5个铝诱导的基因。

利用植物重组DNA在酵母中的异源表达也是分离基因的有效方法,广泛用于养分转运蛋白基因的分离。基本原理是:向某种养分吸收缺失的酵母突变体转入携带植物cDNA的质粒,然后在特定培养基上筛选突变体,一旦获得养分吸收恢复型突变体,其插入的cDNA即可作为探针,从基因组

[15]

DNA文库中分离该养分转运蛋白结构基因。Sentenac(1992)等人就成功的运用该技术路线分别从拟南芥中分离到与钾离子运输有关的cDNA片段,经鉴定为钾离子通道基因。两年后,Schachtman[14]

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农业生物技术学报

[16]

1998年

(1994)又用同样方法从大麦根cDNA文库中分离出高亲和力钾离子转运蛋白cDNA片段hkt1。

[18]

同年,Ninnemann(1994)[17]从拟南芥cDNA文库中分离出高亲和力铵离子转运蛋白cDNA-amt1。Smith(1995)

等从酵母cDNA文库中分离了高亲和力的硫酸盐转运蛋白cDNA-sul1(图2)。

图1　利用差别杂交法分离特异表达基因的技术路线

Fig.1　Stragegyforcloninggeneswithnutrient-inducedexpressionbydifferentialhybridization

图2　Smith等(1995)利用酵母突变体异源基因表达法从植物根系分离硫酸盐转运蛋白基因策略图

Fig.2　ThestragegyusedbySmithetal(1995)forcloningasulphatetransportergene

GAL=半乳糖　ST=硫酸盐转运蛋白　URA=尿嘧啶　AMP=氨苄青霉素GAL=glactose　ST=sulphatetransporterURA=uracil　AMP=ampicillin

此外,目的基因的分离还可采用转座子或T-DNA标签法(TransporsonorT-DNATagging)即利用转座子或T-DNA插入某些基因破坏其结构引起突变(图3),再利用标签DNA(转座子或T-DNA)做探针,对突变体基因组文库进行探测,可选出包含标签DNA在内的部分基因,再用此突变基因的部分序列做探针,从野生型基因文库中分离出完整的目的基因。Tsay(1993)[19]等即是用此方法在拟南芥中分离到编码硝酸盐诱导的硝酸盐转运蛋白基因chl1。

差别显示PCR法(DifferentialDisplayPCR,DD-PCR)是近年来发展起来的一种用于研究诱导基因表达的有效方法。基本原理是:mRNA的3′端具poly(A)尾巴,在oligo(dT)前面的两个碱基中除了倒数第二个碱基不为T外,有4×3=12种组合,以此为引物反转录,可覆盖1/12的cDNA群体,得到1/12的cDNA亚群体,再引入一个5′端引物对cDNA进行亚扩增,底物中掺入󰀁-35S标记的第4期张勇等:分子生物学技术在植物营养学研究中的应用(综述)

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dCTP,进行测序凝胶电泳,电泳后用X-光片曝光,由于5′端引物随机结合在cDNA上,故不同来源的mRNA扩增产物的大小不同,可在X-光自显影照片上分辨其有差异的片段,此即差别表达基因的cDNA片段。张立平等(1997)[20]应用该技术比较了水稻对铝抗性极敏感品种pp2462-11和极抗品种Pedel在铝胁迫下基因的表达差异,发现抗性品种和敏感品种在铝胁迫下苗期mRNA有明显差异,共发现25个差别cDNA,铝既可诱导抗性品种和敏感品种的基因表达,又可抑制其表达。

图3　通过插入T-DNA和转座子破坏植物基因

Fig.3　DisruptplantgenesbyinsertingT-DNAandtransposon

近年来,由于生物基因组大片段YAC文库(YeastArtificialChromosomeLibrary)技术和分子标记遗传连锁图的绘制等方面的进展,使通过以图谱为基础的基因克隆策略克隆完整基因成为可能,目前已应用于番茄、水稻、拟南芥等模式植物中。基于YAC文库和分子标记的基因克隆有两条途径。一是染色体步行法(ChromosomeWalking),即通过YAC大片段步行到目的基因。具体步骤是:构建YAC库,X基因做探针,筛选出与其有共同序列的a克隆,再用a克隆做探针筛选出与其重叠的b克隆,依次筛选c、该方法缺点是技术难度大,工作量大。第二种方法d、e、f…克隆,最终走向目的基因Y。

是染色体登陆法(ChromosomeLanding),尽可能获得与靶基因共分离的DNA分子标记,二者距离应在YAC容量范围内(<2Mb),用此DNA分子标记筛选YAC文库,可望直接发现靶基因的克隆,该技术较第一种省时省力,可有效的应用于植物数量性状座位(QTL)分离上。应用该方法首先分离到的是拟南芥的󰀁-3去饱和脂肪酸基因(fad3),随后,Martin等用类似方法克隆了番茄抗细菌病原体Psendomonassyringae的基因Pto。

总之,分子生物学技术在植物营养研究中的应用方兴未艾,随着学科间的相互渗透,研究工作不断深入、研究领域不断拓展,这些技术必定会在植物营养学科的发展中起到重要推动作用。

参　考　文　献

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ApplicationofMolecularTechnologyin

PlantNutritiionStudy

Zhangyong　MiGuohua　ZhangFusuo

(ChinaAgricultureUniversity,Beijing100094)

Abstact:Inordertounderstandthemechanismofplantnutritionproblems,moreandmoremoleculartechniqueshavebeenapplied.Theutilizationofmolecularmarkingtechniquesinplantnutritionstudyandthestrategiesforcloningnutrient-inducedgeneswerebrieflyreviewed.

Keyword:molecularmarking;genecloning;nutrientcharacters;transporter