姜黄素对CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC_7901作用的影响及其机制的研究

姜黄素对CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用

*

的影响及其机制的研究

蒋允丽,费素娟

1

1*

,陈复兴,刘军权,周忠海

222

(1.徐州医学院附属医院消化内科,江苏徐州221002;2.中国人民解放军第九七医院实验科,江苏徐州221004) 摘要:目的 探讨姜黄素对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用的影响及其机制。方法 10名健康者外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子诱导为CIK细胞;收集培养第5天的CIK细胞,给予不同浓度的姜黄素诱导,37e、5%CO2条件下继续培养72h,LDH法检测CIK细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性;FACS法检测CIK细胞表型CD3+CD8+、CD3+CD56+含量及穿孔素、颗粒酶B水平。结果 ¹姜黄素诱导后,CIK细胞杀伤胃癌SGC-7901的活性明显提高,在10Lmol/L时杀伤活性显著高于对照组(P<0.05)。º姜黄素诱导后,CIK细胞内穿孔素和颗粒酶B的水平明显提高(P<0.05)。»姜黄素能够显著增加CIK细胞的CD3+CD56+表达(P<0.05),降低其CD3+CD8+表达(P<0.05)。结论 姜黄素能提高CIK细胞对胃癌细胞株SGC-7901的杀伤活性,其机制可能与其增加CIK细胞穿孔素和颗粒酶含量以及增加CD3+CD56+表达有关。

关键词:姜黄素;CIK细胞;SGC7901胃癌细胞;杀伤活性;穿孔素;颗粒酶B

中图分类号:R735.2 文献标志码:A 文章编号:1000-2065(2010)04-0223-04

Thecurcumin-inducedCIKcellcytotoxicitytogastriccancercellline

SGC-7901anditsmechanism

JIANGYunli1,FEISujuan1*,CHENFuxing2,LIUJunquan2,ZHOUZhonghai2(1.DepartmentofGastroenterology,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China;2.DepartmentofCentralLaboratory,97thHospital

ofChinesePLA,Xuzhou,Jiangsu221004)

Abstract:Objective Toinvestigatetheeffectandtheunderlyingmechanismofthecurcumin-inducedcytotoxicityofCIKcellstogastriccancercelllineSGC-7901invitro.Methods Theperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)from10healthyvolunteerswereinducedinvitrowithdifferentcytokinesandtransferredintoCIKcells.Onthefifthday,theCIKcellswerecollectedandwereinducedwiththeadditionofcurcuminatdifferentconcentrations,followedby72hoursofcultureundertheconditionof37e

and5%CO2.TheantitumorcytotoxicityofCIKcellstocelllineSGC-7901

wasdeterminedbyLDHassay.ThecontentofphenotypesCD3+CD8+andCD3+CD56+ofCIKcells,thelevelsofperforinandgranzymeBwereanalyzedbyafluorescenceactivatedcellsorter(FACS).Results ¹Theanti-tumorcy-totoxicityofCIKcellsexposedtocurcuminonSGC-7901wasmarkedlyelevatedandthecytotoxicityreached62.32%?1.28%

ataconcentrationof10Lmol/Lcurcumin,withsignificantdifferencesincontrastwiththecontrolgroup

(37.45%?1.12%,P<0.05).ºThelevelofperforinandgranzymeBofCIKcellsinducedbycurcuminremarkablyincreased(P<0.05).»CurcumincouldevidentlyupregulatetheexpressionofCD3+CD56+ofCIKcells(P<0.05)anddownregulatetheexpressionofCD3+CD8+ofCIKcells,comparedwiththecontrolgroup(P<0.05).Conclu-sion CurcumincanenhancedtheCIKcellcytotoxicitytogastriccancerSGC-7901andthismechanismisinvolvedintheincreaseofperforinandgranzymeBcontentaswellastheupregulationofCD3+CD56+expression.

Keywords:curcumin;CIKcells;gastriccancercelllineSGC-7901;perforin;granzymeB

细胞因子诱导的杀伤(cytokineinducedkiller,CIK)细胞是将人外周血单个核细胞在体外经多种

*通信作者,E-mai:lfeisj1031@yahoo.com.cn细胞因子共同诱导培养而获得的一群异质性细胞,与其他过继性免疫细胞相比,由于其具有增殖能力

#224#徐州医学院学报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU 2010,30(4)

强、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造

[1-2]

血影响轻微等优点而被广泛应用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗

[3]

B1比例混合,以1500r/min离心5min,置37e、5%

CO2孵箱中孵育6h后,轻轻混匀,再以1500r/min离心10min。收集上清液,用全自动生化分析仪LD-P法测定LDH的活性(U/L)。 CIK细胞的杀伤活性(%)=(测定管LDH的U-自然释放管LDH的U)/(最大释放管LDH的U-自然释放管LDH的U)@100%

1.2.3 姜黄素对CIK细胞表型的影响 收集经姜黄素诱导72h后的CIK细胞,PBS液洗涤2次,调整细胞浓度为4@10/L,加入离心管,每管100L,l分别加入荧光标记的单克隆抗体CD3、CD8、CD56,每一抗体每孔5L,l各组均设5个复孔对照,4e暗处孵育标记20min,PBS液洗涤,然后用流式细胞仪检测细胞表型。

1.2.4 姜黄素对CIK细胞穿孔素和颗粒酶B水平的影响 收集经姜黄素诱导72h后的CIK细胞,用PBS液洗涤2次,调整细胞浓度为4@10/L,加入离心管(100Ll/管),分别加入荧光标记的穿孔素和颗粒酶B,每管加抗体5L,l各组均设5个复孔对照。4e暗处孵育20min,PBS液洗涤,流式细胞仪检测细胞表型。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0统计软件包进行数据分析,采用One-WayANOVA进行比较,P<0.05认为差异有统计学意义。2 结 果

2.1 姜黄素诱导的CIK细胞对SGC-7901杀伤活性的变化 浓度为2.5~10Lmol/L姜黄素诱导的CIK细胞对SGC-7901细胞杀伤活性明显高于对照组(P<0.05);当姜黄素浓度达20Lmol/L时,CIK细胞杀伤活性明显降低(P<0.05);无水乙醇组和对照组比较无明显差异(图1)。

6

6

。姜黄素(curcumin)是一种从

中药姜黄根茎中提取出来的天然化合物,有研究表

明,高浓度的姜黄素对树突状细胞(dendriticcel,lDC)、CDT有抑制作用

[4-5]

,但有关姜黄素在CIK细

胞作用中的影响鲜见报道,为此,我们试用不同浓度的姜黄素在体外诱导人CIK细胞,观察姜黄素对CIK细胞杀伤活性及其穿孔素、颗粒酶B的影响,以探讨姜黄素对CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用的影响及其机制。1 材料和方法

1.1 材料 姜黄素(购自Sigma公司);人胃腺癌细胞株SGC-7901(购自上海细胞生物研究所);胰蛋白酶、RPMI1640(购自Gibco公司);人AB血清(购自徐州市血站);胎牛血清和淋巴细胞分离液(购自中国科学院血液病研究所);IL-2(购自厦门特宝生物公司);FITC标记的鼠抗人CD56(购自BD公司);PE标记的Perforin(穿孔素)、GranB(颗粒酶B)和PE标记的鼠抗人CD3、APC标记的鼠抗人CD8(均购自杭州联科生物);乳酸脱氢酶试剂盒(购自日本世诺临床诊断制品株式会社);FACSCa-liber流式细胞仪(购自BD公司),流式细胞仪分析软件为CellQues,t每个标本分析细胞数\\1@10/L。1.2 方法1.2.1 姜黄素诱导CIK细胞 抽取10名健康者外周血各10m,l淋巴细胞分离液分离,收集单个核细胞,无菌生理盐水洗涤3次,将细胞按4@10/L悬浮于RPMI-1640培养基中,加入经抗CD3单抗包被的6孔细胞培养板,每孔6m,l加入终含量为5@10U/LrhIL-2和1@10/LrhIFN-C,置37e、5%CO2条件下培养,每2天半量换培养基1次,并调整细胞密度至4@10/L,5天后收集CIK细胞并配成4@10/L的细胞悬液,分别加入不同浓度的姜黄素10(对照组)、1.25、2.5、5、10、202Lmol/L,同时设无水乙醇组(无水乙醇含量为0.1%)。每组设5个复管,置37e、5%CO2条件下继续培养72h收集细胞用于实验。

1.2.2 姜黄素诱导的CIK细胞对SGC-7901杀伤

[6]

活性的检测 按本室建立的方法进行。将SGC-7901细胞株用RPMI-1640培养基培养至对数增殖期;收集细胞用Hankcs液洗2次,配成4@10/L;效应细胞(CIK)配成4@10/L,将效靶细胞数按106

5

6

6

4

6

6

4

图1 姜黄素诱导的CIK细胞对胃癌SGC-7901的杀伤活性

与对照组比较:*P<0.05

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2.2 姜黄素对CIK细胞表型的影响 2.5~10Lmol/L姜黄素诱导的CIK细胞CD3+CD56+比率逐渐升高,10Lmol/L时,CD3+CD56+比率最高(37.96%?1.36%),与对照组(15.44%?1.08%)比较有统计学意义(P<0.05);但浓度升至20Lmol/L时CD3+CD56+比率则降为12.04%?1.55%,较对照组显著减少(P<0.05);无水乙醇组

和1.25Lmol/L姜黄素组与对照组比较无统计学意

义(P>0.05)。见图2。1.25~20Lmol/L姜黄素诱导的CIK细胞CD3+CD8+比率随药物浓度增加而逐渐下降,20Lmol/L时达最低(30.72%?2.46%),明显低于对照组(60.97%?2.71%,P<0.05);无水乙醇组与对照组比较无明显差异(图3)。

图2 姜黄素对CIK细胞表型CD3+CD56+的影响图3 姜黄素对CIK细胞表型CD3+CD8+的影响

与对照组比较:*P<0.05与对照组比较:*P<0.05

2.3 姜黄素对CIK细胞穿孔素和颗粒酶B水平的影响 1.25~10Lmol/L姜黄素诱导的CIK细胞穿

孔素和颗粒酶B水平均较对照组高,浓度在10Lmol/L时穿孔素和颗粒酶B水平显著高于对照组,

两者比较有统计学意义(P<0.05)。无水乙醇组与对照组比较无统计学差异。当姜黄素浓度达20Lmol/L时,两者均明显降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。见表1。

表1 姜黄素对CIK细胞穿孔素和颗粒酶B水平的影响(n=10,󰀁x?s,%)

分 组

无水乙醇组

姜黄素组(Lmol/L) 0(对照组) 1.25 2.5 5 10 20

与对照组比较:*P<0.05

穿孔素 53.17?1.3353.77?1.7959.39?1.28*

65.10?0.68*66.26?0.76*73.45?2.51*45.37?2.11*

颗粒酶B 61.13?2.1660.82?1.8565.54?0.86*

68.63?1.00*73.58?1.13*75.46?2.84*55.32?1.80*

3 讨 论

现有研究证明,姜黄素具有抗炎、抗氧化、清除

[7-8][4]

自由基及抗癌等药理作用。Cipriani等研究表明30Lmol/L以上浓度的姜黄素明显抑制异戊烯焦磷酸盐诱导的CDT细胞的趋化因子释放、扩增和依赖其活性的细胞聚集,此过程和姜黄素抑制NF-JB和AP-1活性有关;并且高浓度的姜黄素能够呈时间和剂量依赖性地抑制CDT细胞杀伤活性,此

过程通过细胞死亡途径,导致核凋亡和大规模DNA断裂。亦有Shirley等

[5]

研究表明浓度为20Lmol/L

及30Lmol/L的姜黄素抑制树突状细胞对免疫刺激

物的反应,通过阻止成熟标志物、细胞因子和趋化因子表达而促进未成熟CD4+T细胞增殖,以及阻止树突状细胞迁移和内吞功能。本实验研究发现浓度为20Lmol/L姜黄素作用于CIK细胞时其杀伤胃腺癌SGC-7901细胞活性明显减低,与上述结果一致。

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CIK细胞是一类非主要组织相容性复合物(ma-jorhistocompatibilitycomplex,MHC)和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞

[9]

参考文献:

[1] 朱寿兴,朱建平,徐鸣,等.CIK细胞体外实验研究及治疗肿瘤

的临床疗效[J].江苏医药,2006,32(11):1093-1095.[2] 梁红,王晓华,隋承光,等.正常人和肿瘤患者CIK细胞的体

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[3] 邹征云,刘宝瑞,钱晓萍,等.从50ml外周血中高效扩增CIK

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activationofVC9VD2Tcellsbyphosphoantigensandinducesap-optosisinvolvingapoptosis-inducingfactorandlargescaleDNAfragmentation[J].JImmuno,l2001,167(6):3454-3462.[5] ShirleySA,MontpetitAJ,LockeyRF,eta.lCurcuminprevents

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[6] 刘军权,韩慧敏,陈复兴.用乳酸脱氢酶试剂盒检测LAK细胞

活性[J].临床检验杂志,1995,13(2):83.

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[10] MehtaBA,Schmidt-WolfIG,WeissmanIL,eta.lTwopath-waysofexocytosisofcytoplasmicgranulecontentsandtargetcellkillingbycytokine-inducedCD3+CD56+killercells[J].Blood,1995,86(9):3493-3499.

[11] SharmaS,ChopraK,KulkarniSK,eta.lResveratrolandcurcu-minsuppressimmuneresponsethroughCD28/CTLA-(1):155-163.

收稿日期:2010-03-05 修回日期:2010-04-13

本文编辑:王卿

4and

CD80costimulatorypathway[J].ClinExpImmuno,l2007,147

,表型以CD3+CD8+和

[10]

CD3+CD56+为主。Mehta等研究认为,CIK细

胞通过释放穿孔素和颗粒酶而裂解靶细胞,提示细胞裂解为杀伤靶细胞的主要机制。穿孔素是存在于细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞和CDT细胞胞质中的细胞毒颗粒,当这些细胞与靶细胞接触后可释放穿孔素,在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道,导致靶细胞溶解破坏。颗粒酶B是杀伤性T淋巴细胞和NK细胞颗粒(granule)中最重要的丝氨酸蛋白酶,通过Caspases依赖途径、直接入核途径及不依赖Caspases的胞质途径杀伤靶细胞。本实验研究显示,浓度2.5~10Lmol/L的姜黄素作用于CIK细胞后,其杀伤活性的增高与其表达的穿孔素和颗粒酶B水平呈正相关,且与CIK细胞的CD3+CD56+表型表达升高一致,考虑CIK细胞杀伤活性增强可能与CIK细胞群中的CD3+CD56+表达增高及其释放穿孔素和颗粒酶B水平升高有关。然而,姜黄素诱导后的CIK细胞CD3+CD8+表型下降机制尚不明确,有待进一步研究。 本实验研究表明,浓度为1.25Lmol/L的姜黄素对CIK细胞的杀伤活性影响不明显,浓度为2.5~10Lmol/L的姜黄素作用于CIK细胞后,其杀伤活性随姜黄素浓度的增加逐渐增强,但当药物浓度过高(达20Lmol/L)时反而会抑制CIK细胞的杀瘤

[11]

作用。这与Sharma等报道的低浓度姜黄素能增强单核巨噬细胞吞噬功能,高浓度则抑制其吞噬功能的结果类似。因此,姜黄素对CIK细胞作用的影响存在最适浓度现象,这一点在设计实验和临床应用时要加以注意。

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