单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用_娄虹

自然科学版第36卷 第3期 2009年

JOURNALOFLIAONINGUNIVERSITY

NaturalSciencesEdition

Vo.l36 No.3 2009

单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用

娄 虹,阮亚男,李其久,韩 阳

(辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳110036)

摘 要:单核苷酸多态性(simplenucleotidepolymorphism,SNP)是等位基因间序列差异最为普遍的类型,可以作为一种高通量的分子标记.本文主要介绍SNP的定义、几种植物学中常用的检测SNP方法及SNP标记在作物遗传育种中的应用.

关键词:单核苷酸多态性;分子标记;遗传育种.

中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1000-5846(2009)03-0280-04

*

分子标记是指能反映生物个体或种群间基因

组中某种差异特征的DNA片段,它能够直接反映基因组DNA间的差异.分子标记可以分为3类:(1)以Southern杂交为基础的分子标记;(2)以PCR为基础的分子标记;(3)以DNA芯片或测序为基础的分子标记.这是依据标记方法进行的分类,同时也体现出DNA分子标记的/进化0特征.第一类代表着第一代分子标记,在上世纪80年代广泛使用;第二类在上世纪90年代迅速发展;进入21世纪后SNP分子标记的价值得到广泛认可

[2,3]

[1]

是基因编码区的突变,主要分布于基因编码区内

(codingregion),故又称其为cSNP;二是遍布于基因组非编码区的大量单碱基变异,又分为基因周边SNP(peripheralSNP,pSNP)及基因间SNP(in-tronicSNP,iSNP).从对生物遗传性状的影响上来看,cSNP又可分为2种:一种是同义cSNP(Synon-ymouscSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同;另一种是非同义cS-NP(non-synonymouscSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响蛋白质的功能.

这种由单核苷酸差异引起的遗传多样性特征可以作为一种分子标记,即SNP标记.

.

1 SNP的定义及分类

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性,其多态性频率大于1%.但在实际研究中,也常把位于cDNA、频率低于1%的单核苷酸变异称为SNP.严格来讲,SNP只涉及到单个碱基的变异,即碱基的转换(包括A与G,T与C互换)和颠换(包括A与C,A与T,G与C,G与T互换),不包括单核苷酸的插失和缺失

[5]

[4]

2 SNP的发掘方法

SNP标记开发的关键是发现SNP位点.目前用于发现SNP的方法有近百种,可以分为两类:基于生物信息学的SNP发掘和通过实验方法发

掘SNP,后者又根据其实验原理分为四种类型:(1)根据DNA构象的不同寻找SNP;(2)基于PCR及酶切的方法;(3)基于杂交的方法;(4)直

.

位于基因组内的SNP可以分为2种形式:一

*

作者简介:娄 虹(1962-),女,江苏苏州人,实验师,从事生物技术研究. 基金项目:辽宁省教育厅科学研究项目(编号:2008Z114) 收稿日期:2009-04-11 第3期 娄 虹,等:单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用

281

接测序法.下面介绍几种植物学中常用的发现SNP方法.2.1 基于生物信息学的SNP发掘

利用生物信息学方法从已有的核酸数据库中搜寻SNP是发现单核苷酸多态性最直接的方法之一.模式植物水稻和拟南芥全基因组序列测定的完成及其它植物大量EST数据的积累为SNP发掘提供了宝贵的资源.将数据库中来源于不同品种的DNA序列进行比对,找出其中的核苷酸差异,这是发现候选SNP最直接的方法.采用生物信息学方法分析植物基因组序列或EST序列已发掘出众多的SNP位点,并且建立了一些SNP位点数据库,如NCBISNP数据库(http://www.nc-b.inlm.nih.gov/projects/SNP/index.html),分子标记数据库(http;//markers.btk.fi/SNPhunter),玉米、小麦、水稻SNP数据库(http://www.cere-alsdb.uk.net/discover.htm)等.在已获得的候选SNP基础上,通过实验对SNP加以验证和确认,使之成为可检测的SNP标记.

这种发掘模式实质是对不同实验室及不同样本的测序数据进行综合分析.它的高效和低成本体现在对现有数据的充分评估和利用上,该方法有助于减少工作的盲目性,并省去许多重复测序工作.

[6]

Nasu等从3个水稻品种DNA中的417个部位搜索SNP,在250000个碱基中共找到2800个SNP.Li等利用水稻广陆矮4号的583kb序列与日本晴对应的602kb序列进行比对,发现了2472个SNP.

2.2 直接测序

PCR扩增目的序列及其产物测序法是检测SNP最直接且信息量最多的方法

[8]

[7]

Bhattramkki等

[9]

用直接测序法对8个玉米

自交系的SNP进行了研究,结果表明,86%基因座的PCR产物具有SNP,52%基因座在两个玉米自交系B73和Mo17之间存在SNP.

2.3 焦磷酸测序技术

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)技术是一种基于发光法测定焦磷酸盐的测序技术.其原理是:引物与模板DNA退火后,在DNA聚合酶(polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfury-lase)、萤光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)4种酶的协同作用下完成循环测序反应.当加入的dNTP与模板互补时,DNA模板与互补的dNTP聚合时可以产生等摩尔焦磷酸(PPi),在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下,PPi与5'-磷酸化硫酸腺苷(APS)反应生成等量的ATP;在萤光素酶催化作用下,ATP与虫萤光素(lucifer-in)反应发光,产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比,根据加入的dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列.在这个过程中,apyrase为核酸降解酶,可以持续地降解没有被掺入的多余的碱基,保证了发光反应的信号与掺入碱基的可参比性,实现了测序分析的定量和定性.

该技术无需进行电泳,DNA片段也不用荧光标记,具有快速、准确、可重复性、并行性和自动化特点,是目前最适合SNP标记应用研究的DNA序列分析技术之一.

[11]

Pacey-Miller等采用焦磷酸测序技术研究了大麦和水稻的SNP;袁群英等

[12]

[10]

采用该技术

发现了水稻中与香味基因紧密连锁的SNP标记.

.所扩增的目

3 SNP标记在作物育种中的应用

3.1 高密度遗传图谱的构建

分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一.随着新的标记技术的发展,图谱上标记的密度也将越来越高.高密度的遗传图谱的出现,使育种工作者可以更精确地进行标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI),降低或消除目的基因之外的遗传背景带来的不利影响,也有助于克隆基因和精确地解析数量性状基因.SNP在同一位点上双等位基因特性及其在基因组中覆盖范围大,使的序列通常是靶基因的非编码区域(如内含子、

3.非翻译区域3.-UTR)或已知EST,根据这些目的序列设计特异引物,使其扩增产物为400-700bp的DNA片段.以不同个体的基因组DNA为模板,用同一PCR反应体系进行扩增.对所获得的扩增产物在3.和5.两个方向上直接测序,仔细核对每个个体的PCR产物序列,就可以查明该目的序列在所测各个体基因组之间是否存在SNP.通过DNA测序技术.282

辽宁大学学报 自然科学版 2009年

之适应于自动化大规模扫描,而且由于其含量丰富,密度高的优势,提供的信息量非常大,已经成为构建高密度的遗传图谱最理想的标记.

国际SNP作图工作组2001年发表的人类基因组图谱已定位了142万个SNP,平均间距1.19[13]

kb.模式植物拟南芥、水稻SNP遗传图谱已构建;大豆、番茄、玉米等其它重要作物SNP遗传图谱的构建工作也取得重大进展.3.2 与性状相关基因的定位

用分子标记指示重要农艺性状,为育种提供服务是SNP标记应用最广泛的一个领域.重要农艺性状基因紧密连锁标记的获得,提高了育种的选择性与预见性,将加快新品种的选育进程.张洪映等以抗旱性不同的45份六倍体小麦和5份小麦的二倍体近缘种为材料,通过测序检测TaPK7基因的单核苷酸多态性,初步揭示了TaPK7基因的单核苷酸多态性与抗旱性之间的相关性.韩志国等克隆了陆地棉TM-1和海岛棉7124中的FIF1基因,根据2个四倍体棉花FIF1基因的SNP,发展了SNP标记和CAPs标记,并将FIF1基因定位于四倍体棉花遗传图谱上.潘存红等

[16]

[15][14]

行种质亲缘关系分析和检测种质多样性的最有效工具之一.利用SNP标记可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系,从而确定亲本间的遗传距离,并进而划分杂交优势,提高杂种优势潜力.SNP标记还可用于种间亲缘关系分析,即计算种群间的

[18]

遗传距离.Germano和Klein通过直接测序法分析云杉种间SNP,鉴定出3个近缘种间的多态性.Kota等对大麦7个基因型180个EST位点进行SNP研究,发现了72个SNP,而且把它们用于大麦亲缘关系研究中.

[19]

4 结语

与其它分子标记相比,SNP具有含量丰富,密度高,覆盖基因组范围大,遗传稳定,而且易于进行自动化、规模化分析等优势,已成为最具潜力的第三代分子标记.随着分子生物学技术的飞跃发展,一些高灵敏度、高通量的SNP检测及基因分型方法日益受到重视.这些检测技术可以满足大样本及多SNP位点的基因分型要求,必将推动SNP标记研究的快速发展.参

考

文

献

在对水稻卷叶基因的精细定位中,通过

籼稻品种93-11与粳稻日本晴的序列BLAST比对,发现了22个InDel标记和15个SNP位点,其中33个标记在检测中表现多态性,通过发展这些标记,最终实现了对卷叶基因的精细定位和克隆.Yang等在对番茄SNP标记开发研究中,利用3个品种的EST数据,在44个基因中发掘了101个候选SNP,经实验检测证明其中的83%是真实的.经进一步实验将46个SNP定位在染色体的特定区域,并证明2个SNP与果实颜色基因座紧密连锁.

3.3 品种鉴定及种质资源管理

种质资源是遗传育种的原材料.据不完全统计,全世界收集的番茄和马铃薯种质资源约有74000份,但是鉴定和利用它们的手段还十分有限.过去种质资源管理及品种鉴定多用叶形、花色、花形态、生长习性、生育期等形态特征描述,但是,随着品种的增多,许多现代育成品种遗传背景相近,根据农艺性状进行管理和鉴定变得十分困难.由于SNP标记能提供精细、准确的特征,已成为进[17]

[1] GuptaPK,VarshneyRK,SharmaPCandRameshB.

Molecularmarkersandtheirapplicationsinwheatbreeding[J].PlantBreed.,1999,118:369-390.[2] GuptaPK,RoyJK,PrasadM.Singlenucleotidepoly-morphisms:anewparadigmformolecularmarkertech-nologyandDNApolymorphismdetectionwithemphasisontheiruseinplants[J].CurrretScience,2001,80(4):524-535.

[3] HayashiK,HashimotoN,

DaigenM,AshikawaI.

DevelopmentofPCR-basedSNPmarkersforriceblastresistancegenesatthePizlocus[J].TheorApplGenet,2004,108:1212-1220.

[4] BrookerAJ.TheessenceofSNPs[J].Gene,1999,

234(2):177-186.

[5] KhlestkinaEKandSalinaEA.SNPmarkers:methods

ofanalysis,waysofdevelopment,andcomparisononanexampleofcommonwheat[J].RussianJournalofGenetics.2006,42(6):585-594.[6] NasuS,

SuzukiJ,OhtaR,HasegawaK,YuiR,

KitazawaN,MonnaLandMinobeY.Searchforandanalysisofsinglenucleotidepolymorphisms(SNPs)in 第3期 娄 虹,等:单核苷酸多态性及其在作物遗传育种中的应用

rice(Oryzasativa,Oryzarufipogon)andestablish-mentofSNPmarkers[J].DNAResearch,2002,9:163-171.

[7] LiC,ZhangY,YingK,LiangXL,HanB.Sequence

variationsofsimplesequencerepeatsonchromosome-4intwosubspeciesoftheAsiancultivatedrice[J].Theor.App.lGenet.,2004,108:392-400.[8] 杜春芳,刘惠民,李润植,李朋波,任志强.单核

苷酸多态性在作物遗传及改良中的应用[J].遗传,2003,25(6):735-739.

[9] BhattramakkiD,DolanM,HanafeyM,WinelandR,

VaskeD,RegisterJC,TingeySV,RafalskiA.Inser-tion2deletionpolymorphismsin3.regionsofmaizegenesoccurfrequentlyandcanbeusedashighlyin-formativegeneticmarkers[J].2002,48(5-6):537-547.

[10] 张晓丹,武海萍,周国华.焦测序技术及其在遗

传分析中的应用[J].分析化学,2006,34(4):582-586.

[11] Pacey-MillerT,HenryR.Single-nucleotidepoly-morphismdetectioninplantsusingasingle-strandedpyrosequencingprotocolwithauniversalbiotinylatedprimer[J].AnalyticalBiochemistry.2003,317(2):166-170.

[12] 袁群英,金庆生.焦磷酸测序技术及其在水稻单

核苷酸多态性研究中的应用[J].浙江农业学报,

PlantMo.l

Bio.,

2007,19(4):325-328.

283

[13] 周延清.2005.DNA分子标记技术在植物研究中

的应用[J].北京:化学工业出版社,207.

[14] 张洪映,毛新国,景蕊莲,谢惠民,昌小平.小麦

TaPK7基因单核苷酸多态性与抗旱性的关系[J].作物学报,2008,34(9):1537-1543.

[15] 韩志国,郭旺珍,张天真.一个FIF1基因的SNP及

定位研究[J].作物学报,2007,33(2):256-261.

[16] 潘存红,王子斌,马玉银,殷跃军,张亚芳,左示敏,

陈宗祥,潘学彪.InDel和SNP标记在水稻图位克隆中的应用[J].中国水稻科学,2007,21(5):447-453.

[17] YangWC,BaiXD,KabelkaE,EatonC,Kamoun

S,KnaapE,FrancisD.Discoveryofsinglenucleo-tidepolymorphismsinLycopersiconesculentumbycomputeraidedanalysisofexpressedsequencetags[J].MolecularBreeding2004,14:2134.

[18] GermanoJ,KleinAS.Speciesspecificnuclearand

chloroplastsinglenucleotidepolymorphismstodistin-guishPiceaglauca,P.marianaandP.rubens[J].Theor.App.lGenet.,1999,99:37-49.

[19] Kota,R.,Varshney,R.K.,Thie,lT.,Dehmer,

K.J.andGraner,A.2001.Generationandcom-parisonofEST-derivedSSRsandSNPsinbarley(HordeumuulgareL.)[J].Hereditas,135:145-151.

SimpleNucleotidePolymorphismandtheApplication

ofSNPMarkerinCropGeneticandBreeding

LOUHong,RUANYa-Nan,LIQ-iJiu,HANYang(SchoolofLifeScience,LiaoningUniversity,Shenyang110036)

Abstrac:t Singlenucleotidepolymorphism(SNP)isthemostcommontypeofsequencedifferencebetween

alleles,whichcanbeusedasakindofhigh-throughputandnewmolecularmarker.ThisreviewintroducedtheSNPdefinition,thedetectionmethodsofSNPinplantsandtheapplicationofSNPmarkerincropgenetic

andbreeding.

Keywords: singlenucleotidepolymorphism(SNP);molecularmarker;geneticandbreeding.

(责任编辑 李 超)