细胞过表达及沉默详细步骤及方法

在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。 1、实验对照组的确立

在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。 2、摸索转染条件

1、293T细胞在6cm dish中培养至80-90%融合时，倾去培养液，用3mL PBS洗涤细胞两次。2、加1mL Trypsin-EDTA solution,混匀后，小心吸去胰酶溶液，37°C放置3分钟。3、再加入2 mL含10% FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。4、血球计数板计数，将细胞稀释至3×105细胞/mL。5、按5×103细胞/孔的浓度接种96孔板，混匀后于37°C5% CO2培养24h。6、转染试剂Lipofectamin2000用于转染过表达质粒，剂量如下，每个剂量设三复孔。Lipo(μL)0.20.30.4质粒(μg)0.20.40.57、在1.5 mL EP管中加入75 μL（25μL/well*3well）无血清DMEM，再加入根据上述表格算出的不同剂量的质粒，混匀；取另一1.5mL EP管，加入75 μL（25μL/well*3well）无血清DMEM，加入根据上述表格算出的相应剂量的Lipofectamin2000，混匀，室温放置5分钟后将两组管混合，室温放置20分钟。吸去96孔板中的培养液，每孔加入50 μL 无血清的DMEM培养液。8、将转染混合物逐滴加入96孔板中，混匀后，在培养箱中温育5小时。9、转染质粒组，吸弃转染液，更换为完全培养基，在培养箱孵育24h后观测。10、如果在转染条件摸索实验中没有找到较高效率的转染方

法，请更换转染方法和试剂。如无其他方法选择，可以使用流式细胞仪将转染的细胞分选出来用于后续实验。如果无法分选细胞，可以在计算基因表达效率时去除转染效率的影响，也可以使用抗生素对转染后的细胞进行初筛后再进一步检测抑制效率。 Lipo(μL) 质粒(μg) 3、细胞转染

设定合理的实验组，包括转染试剂对照（mock transfection）、阴性对照(negative control)和目的基因实验组。2、按照前面实验确定的细胞接种量接种。37°C 5% CO2培养至40-70%融合。3、按照前面实验确定的转染条件转染细胞。如果需要转染不同培养量的细胞，试剂的用量可以根据转染试剂说明书进行相应的变化。4、转染后24-48h后，收集细胞进行下一步的检测工作。通常，目的基因在转染后24-48h内就会表达，但有一些蛋白可根据稳定性、半衰期或表达调控周期的不同，需要适当延长缩短检测时间。 4、基因表达效率的检测

通常用两大类方法来检测过表达质粒中目的基因表达的效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR和Western blot等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。通常多选用qPCR和Western blot等方法直接检测目的基因的变化情况。

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