(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110804102 A(43)申请公布日 2020.02.18
(21)申请号 201911087721.X(22)申请日 2019.11.08
(71)申请人 苏州微超生物科技有限公司
地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区
桑田街218号生物产业园2号楼201单元(72)发明人 胡浩 陈瑞勤 蒋浩然 于旭博 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理
有限公司 44224
代理人 杜帅(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)
(54)发明名称
B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法与应用(57)摘要
本发明提供了一种B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列为将fHBP变体V1的氨基酸序列、fHBP变体V2的氨基酸序列和fHBP变体V3的氨基酸序列通过连接子依次连接，制备得到包含上述多肽片段的融合蛋白，该蛋白易表达、能够正确折叠。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗中以变体V1、变体V2和变体V3任一单变体或其三种变体的混合蛋白制备的疫苗，具有更好的免疫原性，免疫动物后能得到更高滴度的抗体，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。
A61K 39/095(2006.01)
A61K 39/39(2006.01)A61P 31/04(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
权利要求书2页 说明书11页序列表13页 附图3页
CN 110804102 ACN 110804102 A
权 利 要 求 书
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1.一种融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为a:由连接子将SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11连接得到的氨基酸序列；或其氨基酸序列为b:由连接子将SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11连接得到且有1-3个氨基酸突变的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述b为由连接子将SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22连接得到的氨基酸序列；或由连接子将SEQ ID NO.24与SEQ ID NO.25连接得到的氨基酸序列。
4.一种表达如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的编码基因。5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为c:如SEQ ID NO.7所示的序列；或d:与c的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与c的核苷酸序列不同的序列；或e:如SEQ ID NO.7所示的序列有1-6个碱基突变的氨基酸序列；或f：与e的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与e的核苷酸序列不同的序列。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建包含有权利要求4或5所述的编码基因的重组质粒；将所述重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。
7.一种重组质粒，其特征在于，包含有权利要求4或5所述的编码基因。8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET32a(+)。9.一种重组细胞，其特征在于，转化有如权利要求7或8所述的重组质粒。10.一种B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白。11.根据权利要求10所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述融合蛋白包括：嵌合蛋白Ⅰ和嵌合蛋白Ⅱ；所述嵌合蛋白Ⅰ的氨基酸序列为由连接子将SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22依次连接得到的序列；所述嵌合蛋白Ⅱ的氨基酸序列为由连接子将SEQ ID NO.24与SEQ ID NO.25由连接子依次连接得到的序列。
12.根据权利要求11所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述嵌合蛋白Ⅰ和所述嵌合蛋白Ⅱ的摩尔质量比为(0.1-10):1。
13.根据权利要求12所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述嵌合蛋白Ⅰ和所述嵌合蛋白Ⅱ的摩尔质量比为(0.5-5):1。
14.根据权利要求11-13任一项所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
15.根据权利要求10-13任一项所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，还包括：佐剂。16.根据权利要求15所述的B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly(I：C)中的至少一种。
17.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白、权利要求4-5任一项所述的编码基因、权利要求7或8所述的重组质粒、权利要求9所述的重组细胞或权利要求10-13任一项所述的B群脑膜炎球菌疫苗在制备抗B群脑膜炎球菌的抗体中的应用。
18.一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，其特征在于，由如权利要求10-13任一项所述的疫苗
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CN 110804102 A
权 利 要 求 书
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免疫动物而制备得到。
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CN 110804102 A
说 明 书
B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法与应用
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技术领域
[0001]本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
[0002]B群脑膜炎球菌(Neisseria.meningitidis,MenB)不同于其他4种脑膜炎球菌(A,C,W135和Y)的荚膜多糖。研究显示，MenB的荚膜多糖与许多人类细胞(如胎儿的大脑发育期间细胞)表面的糖相似，这种荚膜多糖是α(2→8)N-乙酰神经氨酸(也称多唾液酸)的同聚物。因此，MenB的荚膜多糖在人体内被识别为一种自身抗原，且免疫原性差，不适合作为MenB疫苗开发的有效组分。
[0003]目前对MenB疫苗开发主要集中于非荚膜多糖免疫原，尤其是纯化后重组蛋白形式的膜蛋白或外膜囊泡(OMVs)。新的MenB疫苗发现方法，包括基因组采集、蛋白质组学和免疫学途径，已经鉴定出多个用于免疫预防MenB疾病的新疫苗靶标。这些疫苗靶标包括转铁结合蛋白、肝素结合蛋白(NHA，也称GNA2132)，人类因子H结合蛋白(fHBP，也称为LP2086或GNA 1870)，铁调控的外膜蛋白(FetA)，黏附素A(NadA，也称为GNA 1994)，和其他的蛋白。fHBP是目前MenB最有前景的一种疫苗抗原，它几乎在所有MenB菌株的细胞膜上表达，为一种脂蛋白。fHBP是一种序列高度多样性的表面抗原，可被分为3个变体，每个变体内的氨基酸序列保守性为89-100％，而每个变体间的序列相似性只有59％左右，尤其是变体1(V1)和其他两个变体(V2、V3)之间没有明显的交叉保护反应。
[0004]fHBP的一个重要功能是它可结合人补体因子(fH)。fH与细菌表面结合会加速C3/C5转化酶衰退，这会降低旁路途经激活，且有助于生物体的活力，从而避免非免疫人血清或血液补体介导的杀伤。fHBP作为一个疫苗抗原，抗fHBP抗体即可直接激活经典补体途径溶菌，也可阻止fH与细菌表面结合。
[0005]已有学者对fHBP的结构和抗原表位作了较为深入的研究。fHBP包含A、B、C这3个结构域，结构域A在3个变体中具有高度保守性。V1表达一个位于结构域B的抗原表位，V2和V3的抗原表位主要位于结构域C中，且在V2和V3的结构域C中仅有个别氨基酸差异。已有近12种抗fHBP的单克隆抗体(MAbs)被研究出，而且大多数MAbs对fH与fHBP或细菌表面的结合有明显抑制作用，从而使得细菌对旁路途径介导的溶菌更为敏感。
[0006]目前已上市的2种MenB蛋白疫苗产品中fHBP均以单变体的形式单独或与非fHBP蛋白融合表达。产品针对性预防欧美地区流行性MenB菌株，而对其他的变体菌株并不具有广泛的覆盖性。因此，有必要提供一种提高fHBP的抗原谱、减少生产工序、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体的蛋白，以制备一种更加简单和更加有效的MenB疫苗。发明内容
[0007]基于此，本发明的目的在于提供一种制备方法简单、可刺激机体产生针对不同变体菌株的抗体的B群脑膜炎球菌fHBP多变体融合蛋白及其制备方法。
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CN 110804102 A[0008]
说 明 书
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为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
[0009]一种融合蛋白，其氨基酸序列为a:SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11由连接子依次连接得到的氨基酸序列；或b:SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11由连接子连接得到且有1-3个氨基酸突变的氨基酸序列。
[0010]本发明还提供一种表达如上所述的融合蛋白的编码基因。[0011]本发明还提供一种如上所述融合蛋白的制备方法，具体技术方案如下：[0012]一种如权利要求如上所述的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：[0013]构建包含有如上所述的编码基因的重组质粒；[0014]将所述重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。[0015]本发明还提供了一种重组质粒，具体技术方案如下：[0016]一种重组质粒，包含有如上所述的编码基因。[0017]本发明还提供一种重组菌株，具体技术方案如下：[0018]一种重组菌株，转化有如上所述的重组质粒。[0019]本发明还提供一种B群脑膜炎球菌疫苗，具体技术方案如下：[0020]一种B群脑膜炎球菌疫苗，包括如上所述的融合蛋白。[0021]本发明还提供一种应用，具体如下：[0022]如上所述的融合蛋白、编码基因、重组质粒、重组菌株或B群脑膜炎球菌疫苗在制备抗B群脑膜炎球菌的抗体中的应用。
[0023]本发明还提供一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，具体技术方案如下：[0024]一种抗B群脑膜炎球菌的抗体，由如上所述的疫苗免疫动物而制备得到。[0025]基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：[0026]本发明所述的融合蛋白，通过将V1的N端包括结构域A、B和部分结构域C的部分序列，与V2的结构域C的部分序列进行融合，制备得到包含上述多肽片段的融合蛋白，该蛋白易表达、能够正确折叠。采用该融合蛋白制备得到的疫苗，相对于现有疫苗中以变体V1、变体V2和变体V3任一单变体或其三种变体的混合蛋白制备的疫苗，包含了更多关键抗原表位，免疫动物后能得到抗体具有更高的杀菌活性滴度，其抗原谱比现有的疫苗更广、能够覆盖更多类型的变体菌株。
附图说明
[0027]图1为B群脑膜炎球菌fHBP嵌合蛋白结构设计示意图；[0028]图2为重组质粒pET28a-B01ABpC-A19pC电泳检测结果；泳道1-5是5个不同单菌落经菌液PCR的结果；泳道6表示DNA marker；
[0029]图3为两种嵌合蛋白的SDS-PAGE检测结果；泳道1、2、4、5为嵌合蛋白I经破碎上清、50mM咪唑洗脱和500mM咪唑洗脱样品检测结果，泳道4箭头所指为目的蛋白I；泳道6、7、8、9、10分别为嵌合蛋白II经破碎上清、镍柱流穿、50mM咪唑洗脱、500mM洗脱样品检测结果，泳道9箭头所指为目的蛋白II；泳道3为蛋白marker；[0030]图4为两种嵌合蛋白的WB检测结果；泳道1和2为分别阴性独照；泳道3和4分别为嵌合蛋白I和II与JAR5单抗反应结果；泳道5和6分别为嵌合蛋白I和II与JAR4单抗反应结果；
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CN 110804102 A[0031]
说 明 书
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图5为常规ELISA检测血清抗体滴度检测结果；图中柱状图反映的是经包被的三种
变体蛋白检测的不同免疫组血清抗体水平。
具体实施方式
[0032]为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。[0033]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0034]本发明所述的一种融合蛋白，其氨基酸序列为a:SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11由连接子依次连接得到的氨基酸序列；或b:SEQ ID NO.9与SEQ ID NO.11由连接子连接得到且有1-3个氨基酸突变的氨基酸序列。[0035]优选地，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。[0036]优选地，所述融合蛋白为氨基酸序列为SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22由连接子依次连接得到的氨基酸序列；或SEQ ID NO.24与SEQ ID NO.25由连接子依次连接得到的氨基酸序列。
[0037]本发明所述的融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列为c:如SEQ ID NO.7所示的序列；或d:与c的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与c的核苷酸序列不同的序列；或e:如SEQ ID NO.7所示的且有1-6个碱基突变的氨基酸序列；或f：与e的核苷酸序列编码相同的蛋白质，但因密码子的简并性而与e的核苷酸序列不同的序列。[0038]本发明所述的的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：[0039]构建包含有如上所述的编码基因的重组质粒；[0040]将所述重组质粒转化至宿主细胞中，鉴定，筛选鉴定正确的阳性菌株，将所述鉴定正确的阳性菌株转化至表达细胞；培养。[0041]优选地，所述包含有如上所述的编码基因的重组质粒由所述编码基因的序列通过双酶切插入质粒载体得到。更优选地，所述载体为pET32a(+)。[0042]优选地，所述表达菌株为E.coli BL21(DE3)。[0043]本发明所述的B群脑膜炎球菌疫苗，包括如上任一项所述的融合蛋白。[0044]优选地，所述融合蛋白包括：嵌合蛋白Ⅰ和嵌合蛋白Ⅱ；所述嵌合蛋白Ⅰ的氨基酸序列为SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22由连接子依次连接得到；所述嵌合蛋白Ⅱ的氨基酸序列为SEQ ID NO.24与SEQ ID NO.25由连接子依次连接得到。[0045]优选地，所述嵌合蛋白Ⅰ和所述嵌合蛋白Ⅱ的摩尔质量比为(0.1-10):1。更优选地，所述嵌合蛋白Ⅰ和所述嵌合蛋白Ⅱ的摩尔质量比为(0.5-5):1。[0046]优选地，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
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CN 110804102 A[0047]
说 明 书
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优选地，所述的B群脑膜炎球菌疫苗还包括：佐剂。
[0048]更优选地，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)中的至少一种。更优选地，所述佐剂为氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，或者氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐与适用于人体的其他佐剂的组合物。其中，虽然弗氏佐剂不能用于人用疫苗中，但应当理解的是，其可以作为用于科研中小鼠试验的B群脑膜炎球菌疫苗的佐剂。[0049]其中，对本发明所涉及的名词，解释如下：[0050]佐剂：是与抗原同时或预先注射到动物体内，可非特异性地增强机体对该抗原的免疫应答的物质，或称为非特异性免疫增强剂。[0051]铝盐佐剂：以铝盐作为材料，通过传统工艺制备的一种佐剂，主要包括磷酸铝、氢氧化铝和硫酸铝钾3种，目前常用的铝盐佐剂为氢氧化铝和磷酸铝。[0052]脂质体佐剂：由类脂质组成的人造细胞膜样小球体，主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构。可包括多种疫苗，并有效地引入细胞内，延长在体内停留时间，减少疫苗用量、降低毒副作用，提高免疫功能。[0053]TLR类佐剂：以Toll样受体的配体为基准开发的一类新型疫苗佐剂，如细菌脂多糖是TLR4的配体，鞭毛蛋白是TLR5的配体，细菌或病毒的非甲基化CpG序列为TLR9的配体，以及其他具有佐剂活性TLR配体也包括在内。[0054]MF59：一种由角鲨烯、山梨糖醇三油酸酯(Span85)、吐温80和柠檬酸缓冲液组成的水包油乳剂。[0055]MPL：单磷酰脂质A，为TLR4配体，是已成功开发的TLR类佐剂中的一种。[0056]CpG-ODN：人工合成含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤二核酸的寡聚脱氧核苷酸序列，为TLR9配体。
[0057]Poly(I.C)：为一段人工合成的双链RNA分子类似物，是TLR3配体。[0058]SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。[0059]Native-PAGE：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。[0060]ELISA：酶联免疫吸附测定。[0061]SBA：杀菌活性检测。[0062]CFA：完全弗氏佐剂。[0063]实施例1[0064]1、设计B群脑膜炎球菌fHBP嵌合蛋白[0065]将V1的N端部分序列(包括结构域A、B和部分结构域C，B01ABpC)与V2的结构域C的部分序列(部分结构域C，A19pC)进行融合，它们之间的Linker为fHBP氨基酸序列中的一个小肽段(GEHT)，即B01ABpC-A19pC。由于这两个片段之间没有相似性序列，因此可采用重叠PCR方法对其进行连接(如图1所示)。
[0066]再以B01ABpC-A19pC为模板，通过基因定点突变构建2种嵌合蛋白(嵌合蛋白I：Cp-1和嵌合蛋白II：Cp-2)，如下表1所示。
[0067]表1两种嵌合蛋白的定点突变信息
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2、技术方法
[0070]1)PCR分别扩增3个变体基因：
[0071]采用高保真DNA聚合酶将V1变体B01的N端部分序列(B01ABpC)和V2变体A19的结构域C部分编码基因(A19pC)分别扩增出来。具体如下：[0072]以含有V1变体全长基因序列(SEQ ID NO.1)的pPUC57质粒为模板，以V1F(SEQ ID NO.2)和V1R(SEQ ID NO.3)为引物，采用高保真DNA聚合酶扩增，得B01ABpC，其中加粗划线为相应的限制性内切酶识别序列。[0073]V1,B01(SEQ ID NO.1)：
[0074]ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCACCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGATGCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGTTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGAACAAGATCCAGAGCATTCCGAGAAGATGGTTGCGAAACGCCGGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACATCTTTTGACAAGCTTCCCAAAGACGTCATGGCGACATATCGCGGGACGGCGTTCGGTTCAGACGATGCCGGCGGAAAACTGACCTATACTATAGATTTTGCTGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACATTTGAAATCGCCGGAACTCAATGTCGATCTGGCCGTCGCCTATATCAAGCCGGATGAAAAACACCATGCCGTCATCAGCGGTTCCGTTCTTTACAACCAAGACGAGAAAGGCAGTTACTCCCTCGGTATCTTTGGCGAAAAAGCCCAGGAAGTTGCCGGCAGCGCGGAAGTGGAAACCGCAAACGGCATACACCATATCGGTCTTGCCGCCAAGCAGTAA[0075]V1F(SEQ ID NO.2)：[0076]5’-TTTAAGAAGGAGATATACCATGAGCAGCGGAGGCGGCGGAAG-3’[0077]V1R(SEQ ID NO.3)：[0078]5’-GTTGGTTGAAGGCTGTATGTTCGCCCGCTATGTCG-3’[0079]以含有V2变体全长基因序列(SEQ ID NO.4)的pPUC57质粒为模板，以V2F(SEQ ID NO.5)和V2R(SEQ ID NO.6)为引物，采用高保真DNA聚合酶扩增，得A19pC，其中加粗划线为相应的限制性内切酶识别序列。[0080]V2,A19(SEQ ID NO.4)
[0081]ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCCGCCGACATCGGCGCGGGGCTTGCCGATGCACTAACCGCACCGCTCGACCATAAAGACAAAAGTTTGCAGTCTTTGACGCTGGATCAGTCCGTCAGGAAAAACGAGAAACTGAAGCTGGCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTCAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGCTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAATATACAAACAGGACCACTCCGCCGTCGTTGCCCTACAGATTGAAAAAATCAACAACCCCGACAAAATCGACAGCCTGATAAACCAACGCTCCTTCCTTGTCAGCGGTTTGGGCGGAGAACATACCGCCTTCAACCAACTGCCTGACGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACAC
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GGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCGCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAGGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAG
[0082]V2CF(SEQ ID NO.5)：[0083]5’-CGACATAGCGGGCGAACATACAGCCTTCAACCAAC-3’[0084]V2CR(SEQ ID NO.6)：[0085]5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTGTTTGCCGGCGATGCC-3’[0086]PCR扩增体系为：[0087]10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl2 2μL，DNA模板100 ng，引物F 1.5μL，引物R 1.5μL，KOD-plus-neo高保真PCR酶1μL，ddH2O补足至50μL。[0088]PCR条件为：94℃预变性2 min,98℃变性10s，65℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次，最后68℃延伸5min。将获得的PCR产物经DNA电泳检测，并采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR正确的产物进行纯化回收。
[0089]2)获得B01ABpC-A19pC融合基因[0090]第1轮PCR扩增体系：[0091]第1轮PCR所用的2对引物分别扩增获得B01ABpC(V1F和V1R)和A19pC(V2CF和V2CR)这两个片段。
[0092]10×buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL，MgCl2 1.5μL，B01ABpC模板100 ng，A19pC模板72 ng，KOD-plus-neo高保真PCR酶0.5μL，ddH2O补足至24μL。[0093]反应条件为：94℃预变性2 min，98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸2min，循环5-10次，最后68℃延伸5min。[0094]第2轮PCR扩增体系：[0095]10×buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL，MgCl2 1.5μL，第1轮PCR产物24μL，引物V1F 1.5μL，引物V2CR1.5μL，KOD-plus-neo高保真PCR酶0.5μL，ddH2O补足至50μL。[0096]反应条件为：94℃预变性2 min，98℃变性10s，63℃退火30s，68℃延伸2min，循环35次，最后68℃延伸5min。[0097]经DNA检测后，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，并测定回收产物的DNA浓度。
[0098]3)将回收的PCR产物与适量线性化的pET28a在同源重组酶的作用下，于37℃反应30 min。取适量连接产物通过热激法转化至克隆菌株E.coli DH5α中，涂布抗性平板，37℃倒置孵育过夜。
[0099]4)挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，进行菌液PCR鉴定，反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，循环25次，最后72℃延伸5min。得重组质粒pET28a-B01ABpC-A19pC，并经DNA电泳检测。菌液PCR鉴定的电泳结果见图2。扩增获得的条带与目的片段的大小相符。因采用的是pET28a上的通用引物(T7/T7t)进行菌液PCR鉴定，所以获得的条带应比B01ABpC-A19pC的长250 bp左右。但由于是通过同源重组酶的作用将片段和载体进行连接，所以无需双酶切鉴定这一步。[0100]B01ABpC-A19pC融合基因序列(SEQ ID NO.7)如下：
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CN 110804102 A[0101]
说 明 书
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ATGAGCAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCACCGCCGACATCGGCACGGGGCTTGCCGAT
GCACTAACTGCGCCGCTCGACCATAAAGACAAAGGTTTGAAATCCCTGACATTGGAAGACTCCATTTCCCAAAACGGAACACTGACCCTGTCGGCACAAGGTGCGGAAAAAACTTATGGAAACGGCGACAGCCTTAATACGGGCAAATTGAAGAACGACAAGGTCAGCCGTTTCGACTTTATCCGTCAAATCGAAGTGGACGGGCAGCTCATTACCTTGGAGAGCGGAGAGTTCCAAGTGTACAAACAAAGCCATTCCGCCTTAACCGCCCTTCAGACCGAGCAAGAACAAGATCCAGAGCATTCCGAGAAGATGGTTGCGAAACGCCGGTTCAGAATCGGCGACATAGCGGGCGAACATACAGCCTTCAACCAACTGCCTGACGGCAAAGCCGAGTATCACGGCAAAGCATTCAGCTCCGACGATGCTGGCGGAAAACTGACCTATACCATAGATTTCGCCGCCAAACAGGGACACGGCAAAATCGAACACCTGAAAACACCCGAGCAAAATGTCGAGCTTGCCGCCGCCGAACTCAAAGCAGATGAAAAATCACACGCCGTCATTTTGGGCGACACGCGCTACGGCAGCGAAGAAAAAGGCACTTACCACCTCGCCCTTTTCGGCGACCGCGCCCAAGAAATCGCCGGCTCGGCAACCGTGAAGATAGGGGAAAAGGTTCACGAAATCGGCATCGCCGGCAAACAGTAG
[0102]B01ABpC-A19pC融合基因表达得到的B01ABpC-A19pC融合蛋白的序列(SEQ ID NO.8)如下：
[0103]MSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIA(SEQ ID NO.9)GEHT(SEQ ID NO.10)AFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ(SEQ ID NO.11)
[0104]5)再将鉴定正确的重组质粒送至测序公司进行测序鉴定。[0105]6)将构建正确的重组质粒pET28a-B01ABpC-A19pC为模板，根据方案设计，采用定点突变试剂盒进行定点突变，具体如下：[0106]设计引物：(加粗划线为相应的定点突变碱基)
[0107][0108][0109][0110][0111][0112][0113]
CM1F(SEQ ID NO.12)：:CM1R(SEQ ID NO.13):CM2F(SEQ ID NO.14):CM2R(SEQ ID NO.15):CM3F(SEQ ID NO.16):CM3R(SEQ ID NO.17):
表达嵌合蛋白I的质粒的构建的实验步骤如下：[0114]A)PCR扩增突变的目的质粒并DNA电泳检测[0115]PCR扩增体系：10×buffer 5μL，dNTP 5μL，MgCl2 2μL，B01ABpC-A19pC模板不超过1ng，引物CM1F1.5μL，引物CM1R 1.5μL，KOD-plus-neo 1μL，ddH2O补足至50μL。[0116]PCR扩增条件：94℃预变性2 min，98℃变性10s，61℃退火30s，68℃延伸4min，循环30次，最后68℃延伸5min。
[0117]取少量PCR产物进行DNA电泳检测，若目的片段正确，则进行下一步操作。[0118]B)DpnI酶消化PCR产物，以获得去除甲基化的模板质粒。37℃反应1-2h。[0119]C)同源重组反应连接DpnI酶消化后的产物，反应体系为5×CEII buffer 4μL，DpnI酶消化产物50-400ng，ExnaseII 2μL，ddH2O补足至20μL。混匀后于37℃反应30 min。
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D)转化克隆菌株E.coli DH5α中，涂布抗性平板，37℃倒置孵育过夜；
[0121]E)挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，挑选鉴定正确的阳性克隆进行扩大培养，进行菌液PCR鉴定，反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，循环25次，最后72℃延伸5min。并经DNA电泳检测。
[0122]表达嵌合蛋白II的质粒的构建的实验步骤：[0123]对于连续的多碱基突变，即GCC突变成AAA，其实验操作步骤参照嵌合I的步骤；其中引物为CM3F和引物CM3R；
[0124]对于另外2个不连续的单点突变，即GAG突变成GGG，AAA突变成AGA，其实验操作步骤如下：
[0125]A)从B01ABpC-A19pC模板中分别扩增大片段和小片段，PCR扩增体系和条件同上；其中，扩增大片段的引物为：CM2F/CM1R；扩增小片段的引物为：CM1F/CM2R。[0126]B)DpnI酶消化分别消化大、小片段，并经DNA电泳检测后回收各自的目的片段；[0127]C)同源重组反应连接大片段与-小片段，反应体系为5×CEII buffer 4μL，大片段20-200 ng，小片段20-200 ng，ExnaseII 2μL，ddH2O补足至20μL。混匀后于37℃反应30 min。
[0128]其余操作步骤参照嵌合蛋白I构建的步骤4-6。
[0129]产生2种嵌合蛋白的pET28a重组质粒pET28a-Cp-1和pET28a-Cp-2，并送至测序公司测序鉴定。
[0130]表达嵌合蛋白I的基因序列(SEQ ID NO.18)如下：
[0131]
[0132][0133]
其中加粗斜体为突变位点
表达嵌合蛋白II的基因序列(SEQ ID NO.19)如下：
[0134]
[0135]
其中加粗斜体为突变位点
[0136]7)将两种嵌合蛋白Cp-1和Cp-2重组质粒pET28a-Cp-1和pET28a-Cp-2分别转化至表达菌株E.coliBL21(DE3)。挑取单菌落扩大培养，于37℃、200rpm培养至OD600达到0.8，加
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入终浓度为1 mM IPTG，诱导培养4h，收集菌体。
[0137]8)采用SDS-PAGE检测该融合蛋白是否成功表达。[0138]9)Ni-柱亲和层析纯化融合蛋白，即将收集的菌体的用适量的裂解缓冲液悬匀，并经超声破碎处理，使细胞破碎释放胞内蛋白，离心后的上清进行Ni-柱上样、漂洗和洗脱后收集样品，并经SDS-PAGE检测，结果如图3所示，泳道1表示嵌合蛋白I表达获得的菌体溶液经超声破碎处理、离心后的上清；泳道2表示嵌合蛋白I在Ni柱纯化过程中经50 mM咪唑缓冲液漂洗出的组分；泳道3表示蛋白marker；泳道4表示嵌合蛋白I在Ni柱纯化过程中经500 mM咪唑缓冲液漂洗出的第1管收集组分；泳道5表示嵌合蛋白I在Ni柱纯化过程中经500 mM咪唑缓冲液漂洗出的第2管收集组分；泳道6表示嵌合蛋白II表达获得的菌体溶液经超声破碎处理、离心后的上清；泳道7表示嵌合蛋白II在超声破碎后的上清经Ni柱上样时未与Ni柱结合的组分；泳道8表示嵌合蛋白II在Ni柱纯化过程中经50 mM咪唑缓冲液漂洗出的组分；泳道9表示嵌合蛋白II在Ni柱纯化过程中经500 mM咪唑缓冲液漂洗出的第1管收集组分；泳道10表示嵌合蛋白II在Ni柱纯化过程中经500 mM咪唑缓冲液漂洗出的第2管收集组分。经Ni柱纯化时，泳道2、7和8显示流穿和50 mM咪唑缓冲液漂洗这2步可以出去大部分杂蛋白，而嵌合蛋白I和II分别从500 mM咪唑缓冲液条件下可被洗脱并富集出(对应泳道4和9)，获得纯度相对较高的融合蛋白，大小约29 kDa。[0139]嵌合蛋白I的氨基酸序列(SEQ ID NO.20)如下：
[0140]
[0141][0142]
其中加粗斜体为突变位点
嵌合蛋白II的氨基酸序列(SEQ ID NO.23)如下：
[0143]
其中加粗斜体为突变位点
[0145]其中，Linker序列GEHT用于连接突变的B01ABpC与突变的A19pC，以促进嵌合蛋白I的有效折叠和表达。[0146]9)Western Blot(蛋白印迹)检测蛋白抗原特性，即先采用Native-PAGE胶电泳融合蛋白，再转至PVDF膜上，经封闭、一抗、酶标二抗结合、显色后拍照检测。其中一抗为：单克隆抗体JAR4(NIBSC，09/170)和JAR5(NIBSC，13/216)。检测结果如图4所示，泳道1和2表示阴性对照；泳道3表示嵌合蛋白I与JAR5的反应结果；泳道4表示嵌合蛋白II与JAR5的反应结果；泳道5表示嵌合蛋白I与JAR4的反应结果；泳道6表示嵌合蛋白II与JAR4的反应结果。嵌合蛋白I和嵌合蛋白II均能与两个主要抗原表位的单克隆抗体JAR4和JAR5发生结合反应。这两种嵌合蛋白(I和II)与单克隆抗体JAR5和JAR4均有很强的结合反应。这表明在两种嵌合蛋白在表达折叠的过程中成将JAR5和JAR4识别的抗原表位展现出来。虽然嵌合蛋白I和
[0144]
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II的理论分子量大小一样，但经Native-PAGE检测时会因其天然结构、所带电荷等因素影响而变得不一样大。
[0147]实施例2疫苗制备与免疫效果测试[0148]疫苗制备：在无菌条件下，将实施例1所述的嵌合蛋白I(Cp-1)和嵌合蛋白II(Cp-2)等摩尔质量混匀，再将其与弗氏佐剂(第1次免疫用完全弗氏佐剂，第2次免疫用不完全弗氏佐剂)以体积比1:1混合。[0149]对比疫苗：等量的变体V1蛋白和变体V2蛋白(氨基酸序列分别为SEQ ID NO.26-27)混匀后与弗氏佐剂以体积比1:1混合，且确保两个等量变体蛋白的总摩尔质量和嵌合蛋白I和嵌合蛋白II的总摩尔质量同等，于冰浴条件下进行超声乳化。[0150]SEQ ID NO.26[V1，B01，成熟肽]
[0151]MSSGGGGSGGGGVTADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSISQNGTLTLSAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQDPEHSEKMVAKRRFRIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVDLAVAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGEKAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQSEQ ID NO.27[V2，A19，成熟肽]
[0152]MSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ[0153]小鼠免疫：4-6周龄小鼠40只，分为4组：[0154]第一组：阴性对照(PBS)；[0155]第二组：实施例1所述的嵌合蛋白I和嵌合蛋白II的等摩尔质量混合物，混有弗氏佐剂，Cp-1+Cp-2+弗氏佐剂；[0156]第三组：两个变体蛋白混合-弗氏佐剂，V1+V2+CFA；[0157]第四组：嵌合蛋白I混合弗氏佐剂，摩尔质量与嵌合蛋白I和嵌合蛋白II混合物的总摩尔质量相同；[0158]第五组：嵌合蛋白II混合弗氏佐剂，摩尔质量与嵌合蛋白I和嵌合蛋白II混合物的总摩尔质量相同；
[0159]除了对照组，每只小鼠的免疫剂量中蛋白含量为10μg。在第0周和第4周各免疫1剂，共免疫2剂，腹腔注射，且在最后一次免疫后的第2周进行眼球采血。[0160]一、常规ELISA检测血清抗体滴度
[0161]先用用等量的三个变体蛋白的单体分别包被96孔板，封闭后，依次加入不同稀释倍数的一抗血清孵育、酶标二抗孵育、加入酶检测底物、检测，结果如图5所示。可见，本发明制备得到的疫苗Cp-1+Cp-2+弗氏佐剂，能够诱导小鼠产生更高滴度的血清抗体，具有更好的免疫原性。[0162]二、SBA检测血清的杀菌活性
[0163]先将MenB菌株涂布于巧克力平板上，于37℃、5％CO2条件下培养过夜，将单菌落接种于Mueller-Hinton培养基中将菌液初始OD620控制在0.05-0.08，于37℃摇床培养至OD620达到0.23-0.24，并测定菌活力。所有所需被测试的小鼠血清先于56℃加热灭活30 min，每孔中总体积为50μL，包括25μL连续两倍稀释的测试血清、12.5μL细菌工作液和12.5μL兔补
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体。PBS对照组的比值(1:1)指的是，对照组血清不稀释与菌液和抗体混合后菌落如不加血清的对照组一样正常生长。免疫血清组的比值指的是将免疫血清2倍系列稀释，分别与菌液和补体混合涂板，以不出现菌落的免疫血清最高稀释度作为免疫血清的SBA效价。加入补体后，立即取10μL对照涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育1h。每个样品各取7μL点在Mueller-Hinton琼脂平板上，于37℃孵育18h。表1数据表示的是小鼠免疫血清对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性。可见嵌合体-I和嵌合体-II的组合物在弗氏佐剂的辅助下所诱导的杀菌活性高于嵌合体单独或V1和V2的混合物，提示该嵌合体的组合物由于包含了不同变体之间的关键抗原表位，诱导的有效抗体之间可能由于相互的协同作用对B群脑膜炎球菌大多数检测菌株均有杀菌活性。
[0164]表1小鼠血清对不同fHBP变异体菌株的杀菌活性
[0165]
[0166]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实
施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0167]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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序列表<110> 苏州微超生物科技有限公司<120> B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法与应用<160> 27<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 783<212> DNA<213> artificial sequence<400> 1atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 60cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420ggcgaacata catcttttga caagcttccc aaagacgtca tggcgacata tcgcgggacg 480gcgttcggtt cagacgatgc cggcggaaaa ctgacctata ctatagattt tgctgccaaa 540cagggacacg gcaaaatcga acatttgaaa tcgccggaac tcaatgtcga tctggccgtc 600gcctatatca agccggatga aaaacaccat gccgtcatca gcggttccgt tctttacaac 660caagacgaga aaggcagtta ctccctcggt atctttggcg aaaaagccca ggaagttgcc 720ggcagcgcgg aagtggaaac cgcaaacggc atacaccata tcggtcttgc cgccaagcag 780taa 783<210> 2<211> 42<212> DNA<213> artificial sequence<400> 2tttaagaagg agatatacca tgagcagcgg aggcggcgga ag 42<210> 3<211> 35<212> DNA<213> artificial sequence<400> 3gttggttgaa ggctgtatgt tcgcccgcta tgtcg 35<210> 4<211> 765
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序 列 表
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<212> DNA<213> artificial sequence<400> 4atgagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cggggcttgc cgatgcacta 60accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540gaacacctga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgccg ccgccgaact caaagcagat 600gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcagcgaaga aaaaggcact 660taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720ataggggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765<210> 5<211> 35<212> DNA<213> artificial sequence<400> 5cgacatagcg ggcgaacata cagccttcaa ccaac 35<210> 6<211> 35<212> DNA<213> artificial sequence<400> 6cgacatagcg ggcgaacata cagccttcaa ccaac 35<210> 7<211> 780<212> DNA<213> artificial sequence<400> 7atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 60cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360
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gatccagagc attccgagaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420ggcgaacata cagccttcaa ccaactgcct gacggcaaag ccgagtatca cggcaaagca 480ttcagctccg acgatgctgg cggaaaactg acctatacca tagatttcgc cgccaaacag 540ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780<210> 8<211> 259<212> PRT<213> artificial sequence<400> 8Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala145 150 155 160Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 165 170 175Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 180 185 190Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 195 200 205His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
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序 列 表
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210 215 220Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly225 230 235 240Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 245 250 255Gly Lys Gln<210> 9<211> 140<212> PRT<213> artificial sequence<400> 9Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala 130 135 140<210> 10<211> 4<212> PRT<213> artificial sequence<400> 10Gly Glu His Thr1
<210> 11<211> 115<212> PRT
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<213> artificial sequence<400> 11Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala1 5 10 15Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 20 25 30Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 35 40 45Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 50 55 60His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly65 70 75 80Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly 85 90 95Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 100 105 110Gly Lys Gln 115<210> 12<211> 36<212> DNA<213> artificial sequence<400> 12gagcattccg ggaagatggt tgcgaaacgc cggttc 36<210> 13<211> 37<212> DNA<213> artificial sequence<400> 13aaccatcttc ccggaatgct ctggatcttg ttcttgc 37<210> 14<211> 37<212> DNA<213> artificial sequence<400> 14ggacacggca gaatcgaaca cctgaaaaca cccgagc 37<210> 15<211> 32<212> DNA
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序 列 表
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<213> artificial sequence<400> 15gtgttcgatt ctgccgtgtc cctgtttggc gg 32<210> 16<211> 41<212> DNA<213> artificial sequence<400> 16agatttcgcc aaaaaacagg gacacggcaa aatcgaacac c 41<210> 17<211> 45<212> DNA<213> artificial sequence<400> 17gtccctgttt tttggcgaaa tctatggtat aggtcagttt tccgc 45<210> 18<211> 780<212> DNA<213> artificial sequence<400> 18atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 60cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360gatccagagc attccgggaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420ggcgaacata cagccttcaa ccaactgcct gacggcaaag ccgagtatca cggcaaagca 480ttcagctccg acgatgctgg cggaaaactg acctatacca tagatttcgc cgccaaacag 540ggacacggca aaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780<210> 19<211> 780<212> DNA<213> artificial sequence<400> 19atgagcagcg gaggcggcgg aagcggaggc ggcggtgtca ccgccgacat cggcacgggg 60
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序 列 表
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cttgccgatg cactaactgc gccgctcgac cataaagaca aaggtttgaa atccctgaca 120ttggaagact ccatttccca aaacggaaca ctgaccctgt cggcacaagg tgcggaaaaa 180acttatggaa acggcgacag ccttaatacg ggcaaattga agaacgacaa ggtcagccgt 240ttcgacttta tccgtcaaat cgaagtggac gggcagctca ttaccttgga gagcggagag 300ttccaagtgt acaaacaaag ccattccgcc ttaaccgccc ttcagaccga gcaagaacaa 360gatccagagc attccgggaa gatggttgcg aaacgccggt tcagaatcgg cgacatagcg 420ggcgaacata cagccttcaa ccaactgcct gacggcaaag ccgagtatca cggcaaagca 480ttcagctccg acgatgctgg cggaaaactg acctatacca tagatttcgc caaaaaacag 540ggacacggca gaatcgaaca cctgaaaaca cccgagcaaa atgtcgagct tgccgccgcc 600gaactcaaag cagatgaaaa atcacacgcc gtcattttgg gcgacacgcg ctacggcagc 660gaagaaaaag gcacttacca cctcgccctt ttcggcgacc gcgcccaaga aatcgccggc 720tcggcaaccg tgaagatagg ggaaaaggtt cacgaaatcg gcatcgccgg caaacagtag 780<210> 20<211> 259<212> PRT<213> artificial sequence<400> 20Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala145 150 155 160Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 165 170 175
21
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序 列 表
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Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 180 185 190Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 195 200 205His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly 210 215 220Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly225 230 235 240Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 245 250 255Gly Lys Gln<210> 21<211> 140<212> PRT<213> artificial sequence<400> 21Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala 130 135 140<210> 22<211> 115<212> PRT<213> artificial sequence<400> 22
22
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序 列 表
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Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala1 5 10 15Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 20 25 30Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 35 40 45Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 50 55 60His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly65 70 75 80Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly 85 90 95Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 100 105 110Gly Lys Gln 115<210> 23<211> 259<212> PRT<213> artificial sequence<400> 23Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140
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序 列 表
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Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala145 150 155 160Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 165 170 175Ala Lys Lys Gln Gly His Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 180 185 190Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 195 200 205His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly 210 215 220Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly225 230 235 240Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 245 250 255Gly Lys Gln<210> 24<211> 140<212> PRT<213> artificial sequence<400> 24Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Gly Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala 130 135 140<210> 25
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序 列 表
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<211> 115<212> PRT<213> artificial sequence<400> 25Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala1 5 10 15Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe 20 25 30Ala Lys Lys Gln Gly His Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu 35 40 45Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser 50 55 60His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly65 70 75 80Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly 85 90 95Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala 100 105 110Gly Lys Gln 115<210> 26<211> 260<212> PRT<213> artificial sequence<400> 26Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp1 5 10 15Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys 20 25 30Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn 35 40 45Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn 50 55 60Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg65 70 75 80Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu 85 90 95Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr 100 105 110
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序 列 表
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Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met 115 120 125Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr 130 135 140Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr145 150 155 160Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp 165 170 175Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro 180 185 190Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys 195 200 205His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys 210 215 220Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val Ala225 230 235 240Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu 245 250 255Ala Ala Lys Gln 260<210> 27<211> 254<212> PRT<213> artificial sequence<400> 27Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu1 5 10 15Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln 20 25 30Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu 35 40 45Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn 50 55 60Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg65 70 75 80Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe 85 90 95Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu 100 105 110
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Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser 115 120 125Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu 130 135 140Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp145 150 155 160Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly 165 170 175His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu 180 185 190Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu 195 200 205Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala 210 215 220Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys225 230 235 240Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
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