蛋白质的等电点测定及性质实验

蛋白质的等电点测定及性质实

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蛋白质的等电点测定及性质实验

一、实验目的

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，并了解蛋白质的性质。 二、实验原理

蛋白质分子是两性电解质，当调节溶液的酸碱度，使蛋白质分子上所带的正负电荷相等时，在电场中，该蛋白质分子既不向正极移动，也不向负极移动，这时溶液的pH值，就是该蛋白质的等电点（pI）。不同蛋白质，等电点不同。在等电点时，蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。因此，可以借助在不同pH溶液中的某蛋白质的溶解度来测定该蛋白质的等电点。

在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。蛋白质的盐析作用是可逆过程。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解。而重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 三、试剂和器材

⑴高筋面粉、低筋面粉。

⑵1mol/L醋酸。（每组自配0.1mol/L醋酸、0.01mol/L醋酸） ⑶0.5%酪蛋白溶液。

称取2.5克酪蛋白，放入烧杯中，加入40℃的蒸馏水，再加入50毫升1N氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。在容量瓶中再加入1N醋酸溶液50毫升，摇匀，再加蒸馏水定容至500毫升，得到略显混浊的、在0.1N NaAc溶液中的酪蛋白溶液。

⑷鸡蛋白溶液。

将80mL鸡蛋清与800mL蒸馏水混合均匀后，用洁净的多层湿纱布垫在漏斗上过滤，滤液即为鸡蛋白溶液（不能有不溶性物悬浮）。要现配现用，最好使用经过煮沸并封在容器中隔绝空气冷却的蒸馏水。

⑸质量分数为5%的CuSO4溶液。（每排3组合配） ⑹(NH4)2SO4饱和溶液。（确保有固体析出） ⑺天平、水浴锅、移液管、试管等。

四、操作步骤

1、蛋白质的等电点测定

⑴取5支同种规格的试管，编号，按表1顺序精确加入各种试剂，特别注意0.5%酪蛋白溶液最后加入，然后逐一振荡试管，使试管混合均匀。此时1、2、3、4、5管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、4.1、3.5。

⑵将上述试管静置于试管架上15min后，仔细观察，比较各管的浑浊度，将观察的结果记录于表格内，并指出酪蛋白的等电点。

注意：本试验各种试剂的浓度及用量均要求很准确，确保缓冲液的pH值准确；浑浊度可用－、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示，最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。

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表2-1蛋白质的等电点测定表 试管号 1 2 3 4 5 蒸馏水/mL 8.4 8.7 8.0 7.4 1mol/L醋酸/mL 0.1mol/L醋酸/mL 0.3 1.0 9.0 0.01mol/L醋酸/mL 0.6 0.5%酪蛋白溶液/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 浑浊度 1.6 2、蛋白质性质实验 ⑴蛋白质的盐析 在试管里加入1~2mL鸡蛋白的水溶液，然后逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液，观察现象（有无白色混浊产生）。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。 把少量混浊倾入另一支盛有蒸馏水的试管里，观察白色混浊是否溶解。 ⑵蛋白质的变性 在试管里加入2mL鸡蛋白的水溶液，沸水浴加热5min，观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。 把试管里加入3mL鸡蛋白的水溶液，然后加入1mLCuSO4溶液，观察现象（有无淡蓝色絮状混浊沉淀产生）。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。 ⑶蛋白质发泡性 取100mL烧杯，装入5mL鸡蛋白的水溶液，插入1mL移液管，用吸耳球不断鼓入空气1min，观察发泡情况（泡沫数量、泡沫持续时间）。 另取100mL烧杯，装入5mL蒸馏水，插入1mL移液管，用吸耳球不断鼓入空气1min，观察发泡情况（泡沫数量、泡沫持续时间）。 3、面粉中面筋的粘弹性 ⑴将20g高筋面粉加9mL水揉成面团（注意朝着一个方向揉捏）。另外将20g低筋面粉加9mL水揉成面团（注意朝着一个方向揉捏），要求揉捏有力。 ⑵将上述揉捏好的面团静止15min以上。 ⑶将上述静置好的面团，用手握住，不断在水中揉洗（注意朝着一个方向揉捏）。直至没有淀粉洗出为止，即无白色液体流下。 ⑷将上述洗好的面团放置60min以上，使得表面水分挥发。 ⑸用手揉捏上述两个面团，观察两个面筋的粘弹性及拉伸成薄膜的情况，并进行对比。 4、自主设计实验 根据兴趣爱好，3-6位同学为一组，查找相关资料，开展趣味自主设计实验，或者对在本实验基础上，进行扩展实验。 五、实验要求 1、记录各实验结果并解释相关实验现象。 3

2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？

3、当实验结果与已知发生较大误差时，试着分析其原因。

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