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HBV整合引起HepG2细胞microRNA表达谱变化分析

2024-01-27 来源:客趣旅游网
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第29卷第22期第 三 军 医 大 学 学 报Vol.29,No.22

    

2007年11月ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAENov.2007

论著

HBV整合引起HepG2细胞microRNA表达谱变化分析

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文章编号:100025404(2007)2222128203

韩俊峰,阮志华,张 蓓,吴玉章  (第三军医大学:1基础医学部全军免疫学研究所,2西南医院肿瘤科,重庆400038)

  提 要:目的 分析HBV整合后引起的肝细胞microRNA表达谱的变化情况。方法 利用microRNA芯片,以稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为HBV感染模型,以HepG2细胞为对照,分析二者microRNA表达谱的异同,得到因HBV感染而产生变化的microRNA;并用定量PCR技术来验证结果的可靠性。结果 通过microRNA芯片分析和定量PCR验证,HBV感染后可使hsa2miR230a25p、hsa2miR224、hsa2let27a、hsa2let27c、hsa2let27f和hsa2miR223b6种microRNA下调,使hsa2

miR2194、hsa2miR2200a和hsa2miR23453种microRNA上调。结论 HBV整合后,可引起肝脏细胞microRNA表达谱变化。

  关键词:microRNA芯片;HBV;microRNA  中图法分类号:R322.47;R394.3;R512.620.2

文献标识码:A

DifferentialmicroRNAexpressionprofileofHepG2cellsinducedbyHBVintegration

12112

HANJun2feng,RUANZhi2hua,ZHANGBei,WUYu2zhang(1InstituteofImmunology,CollegeofMedicine,Departmentof

Oncology,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

  Abstract:Objective ToinvestigatethedifferentialexpressionsofmicroRNAafterHBVintegration.

Methods AhumanmicroRNAmicroarraywasusedtoanalyzethemicroRNAexpressionprofileinHepG2.2.15cellline,anovelmodelofHBVinfection.HepG2cellsservedasamockcontrol.Thenthemi2croRNAwithdifferentialexpressionwereprovedusingreal2timePCR.Results HBVinfectioninduced6mi2croRNAdown2regulated(hsa2miR230a25p,hsa2miR224,hsa2let27a,hsa2let27c,hsa2let27fandhsa2miR223b)and3microRNAup2regulated(hsa2miR2194,hsa2miR2200aandhsa2miR2345).Conclusion HBVintegra2tioncaninducethechangesofmicroRNAexpressionprofileinhepatocytes.  Keywords:microRNAmicroarray;HBV;microRNA.  microRNA是一类21~23nt长的非编码单链小分子RNA,是由pri2RNA分子经过剪切形成的70~90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体(pre2miR2

[1]

NA),再经Dicer酶加工生成。microRNA广泛存在于真核生物中,迄今为止在人体中已经发现了数百种microRNA分子。microRNA通过与mRNA的3′端非编码区相互作用,在基因表达调控中发挥重要作用。研究表明,人类基因中至少有1/3受到microRNA的调[2]

控。最近研究表明,许多病毒感染宿主细胞后,可使宿主细胞中的microRNA表达谱发生变化,达到调控宿主细胞内基因表达的目的,使宿主细胞内环境更

[3]

有利于病毒的繁殖、复制。但HBV感染后,肝细胞

  基金项目:国家自然科学基金青年基金(30400385)

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationforYoungScholars(30400385)

内microRNA发生的变化还不是很清楚。本研究借助

于人microRNA芯片技术,探讨HBV感染引起的肝细胞microRNA表达谱变化情况,为进一步阐明乙型肝炎的致病机制及其防治提供理论基础。1 材料与方法1.1 细胞培养

  HepG2细胞和HepG2.2.15细胞均购自ATCC,HepG2.2.15细胞是在HepG2细胞的基因组中整合了完整的HBV基因组,能持续转录和翻译HBV基因,产生病毒抗原和病毒颗粒。

HepG2.2.15、HepG2细胞培养选用含10%胎牛血清(HyClone)和RPMI1640培养液(Gibco)。HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓

度的培养液,另外加入终浓度为380μg/ml的G418(Sigma)。上述两种细胞均在37℃含5%CO2的孵箱中培养。

1.2 细胞总RNA的提取

  按照Trizol(Invitrogen)说明书,提取对数生长期的HepG2细胞和HepG2.2.15细胞的总RNA。紫外分光光度计测定吸光度值D(260)和D(280),对总RNA进行定量;并计算D(260)/

D(280)值,结合甲醛变性凝胶电泳,分析RNA质量。

  作者简介:韩俊峰(1978-),男,山东省济宁市人,博士研究生,讲师,主要从

事乙型肝炎发病机制及防治方面的研究。电话:(023)68752236

  通讯作者:吴玉章,电话:(023)68752236,E2mail:wuyuzhang@yahoo.com.cn  收稿日期:2007209224;修回日期:2007210218

第22期   韩俊峰,等.HBV整合引起HepG2细胞microRNA表达谱变化分析  2129

1.3 芯片分析差异表达的microRNA

  本实验中采用丹麦Exiqon公司的8.1版microRNA芯片。

该芯片采用基于Exiqon专利技术的含锁定核苷酸(lockednu2cleicacids,LNA)捕获探针,可极大增强探针与互补的靶DNA或RNA的亲和活力,能够高灵敏、高特异性的检测microRNA的表达,能准确检测样品中所有microRNA的表达水平[4]。同时,每张芯片对同一样品重复4次检测,进一步提高了芯片的可靠性。Exiqon公司的microRNA芯片附着有1500个microR2NA精确配对的探针、对照探针以及错配探针,可以检测SangermiRBase数据库8.1版中所有人、小鼠、大鼠和其他物种的mi2croRNA。本实验中,我们以稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞作为实验组,以HepG2细胞作为对照组,分别取5μg总RNA,利用miRCURYTMArrayLabellingkit(Ambion)标记Cy3荧光,然后进行芯片杂交,杂交后的芯片使用Genepix4000B进行图像扫描,采用GenepixPro6.0软件进行数据分析,以芯片中的内对照荧光值为参照,分别计算实验组和对照组标准值。2.2 芯片检测结果

  来自HepG2细胞和HepG2.2.15细胞的总RNA经Cy3荧光标记后,同microRNA芯片进行杂交。使用Genepix4000B对杂交后的芯片进行图像扫描,结果如图2所示。通过Genepix

Pro6.0分析所得数据,我们得到上调或下调超过2倍的显著

差异表达的microRNA:其中显著上调microRNA分子有3个,分别为hsa2miR2194、hsa2miR2200a和hsa2miR2345;显著下调的

microRNA分子有6个,分别为hsa2miR230a25p、hsa2miR224、hsa2let27a、hsa2let27c、hsa2let27f和hsa2miR223b。

1.4 定量PCR验证差异表达的microRNA

  为了进一步验证芯片结果的可靠性,利用miR2qRT2PCR

定量PCR试剂盒(AppliedBiosystems),以U6作为内参照,对差异表达的microRNA分子进行实时定量PCR验证。实验中所用引物均由AppliedBiosystems公司提供,整个反应参照试剂盒说明书进行。逆转录反应:取总RNA2ng为初始模板,反应体系为10μl;反应条件:37℃1h。定量PCR反应:取2μl逆转录产物为模板,反应体系为20μl,每个检测指标做2个复孔;反应条件为:95℃,2min;95℃,15s;60℃,30s;40个循环。

ΔΔCT公式分析[5],判定待检分子的上调、最终所得数据用22

下调及其幅度。

2 结果

2.1 细胞总RNA质量检测

  为了检测HepG2细胞和HepG2.2.15细胞的总RNA能否满足后续芯片实验的需要,我们通过紫外分光光度计测定D(260)/D(280)值,观察甲醛变性电泳带型来分析总RNA质量。紫外分光光度计检测结果表明,HepG2细胞总RNAD(260)/D(280)值为1.86,HepG2.2.15细胞总RNAD(260)/D(280)值为1.8;电泳结果提示18S和28S条带均清晰可见,且亮度比为1∶2(图1)。因此,实验结果均提示来自HepG2细胞和HepG2.2.15细胞的总RNA有较好的质量,能满足microRNA后续芯片实验的需要。

A:HepG2细胞;B:HepG2.2.15细胞

图2 Cy3标记的总RNA与microRNA芯片杂交图

2.3 定量PCR分析

  分别以来自HepG2和HepG2.2.15细胞的cDNA分子为模板,利用miR2qRT2PCR定量PCR试剂盒,进行Taqman探针荧光定量PCR。结果见表1,提示定量PCR结果与芯片结果趋势一致,表明芯片结果是可靠的。

表1 定量PCR检测差异表达的microRNA

microRNA分子

芯片结果

hsa2miR2194hsa2miR2200ahsa2miR2345

2.02.82.02.02.13.43.02.22.0

定量PCR结果

5.010.66.12.25.54.94.03.24.7

上调的microRNA

下调的microRNAhsa2miR230a25phsa2miR224hsa2let27ahsa2let27chsa2let27fhsa2miR223b

1:HepG2细胞;2:HepG2.2.15细胞

芯片结果为实验组标准值/对照组标准值;定量PCR结果通过ΔΔCT公式计算得到22

图1 HepG2细胞和HepG2.2.15细胞的总RNA电泳图

21303 讨论

             第 三 军 医 大 学 学 报            第29卷

5p、hsa2miR224、hsa2let27a、hsa2let27c、hsa2let27f和hsa2miR223b6种microRNA显著下调,使hsa2miR2194、hsa2miR2200a和hsa2miR23453种microRNA显著上

  microRNA是一类非编码的小RNA分子,有5′端磷酸基和3′端羟基,定位于RNA前体的3′端或5′端。自第1个microRNA(lin24和let27)分子在线虫中被发[6]

现以来,迄今为止已在包括人类、果蝇、植物等多种

[7]

生物物种中鉴别出超过3500种microRNA分子。目前越来越多的研究表明,microRNA通过与靶基因的相互作用,调控着人类至少1/3基因的表达,在生理和

[2]

病理过程中均具有重要作用。  有研究者推测包括病毒在内的一些感染性疾病,可能通过改变宿主细胞内的特定microRNA的表达,进而调控宿主细胞中特定基因的表达,使宿主细胞内环境更有利于病毒的复制、传播,有利于病毒逃逸宿主[3]

的免疫系统。例如,在HIV感染HeLa细胞的实验中发现,HIV病毒感染可以使HeLa细胞的hsa2mi2croRNA表达谱发生改变,可以使hsa2miR2193、hsa2miR2148b、hsa2miR216、hsa2miR2221等多种microRNA下调,使有利于HIV病毒在HeLa细胞内生存的基因

[8]

表达上调。因此,从某种程度上讲,探索病毒与宿主细胞的相互作用,研究病毒感染对宿主细胞microR2NA表达谱的影响,有利于阐明病毒感染性疾病的致病机制,对这类疾病的防治也具有指导意义。

  HBV能否通过影响肝细胞内microRNA分子的表达,进而达到控制肝细胞内特定基因表达的目的,目前还不清楚。在本研究中,我们借助于Exiqon公司811版的microRNA微阵列芯片,以整合HBV全基因组、能分泌HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞作为HBV感染的细胞模型,分析HBV感染引起的肝细胞microR2NA表达谱的变化,结果表明,HBV感染能引起肝细胞内microRNA表达谱发生改变,能引起hsa2miR230a2  (上接2127页)

似,实验室病原学诊断对组织胞浆菌菌体与黑热病利杜体形态不易鉴别,常致误诊。因此对不明原因发热、肝脾肿大、三系降低、抗生素治疗无效的患者,在除外常见病的基础上,应当考虑本病的可能,进而行骨髓涂片检查。由于该病患者的骨髓真菌培养阳性率不高,因此仔细检查首次涂片显得尤为重要,对骨髓片要反复仔细寻找组织胞浆菌孢子及典型表现,避免延误病情。

  治疗上主要是抗真菌治疗,两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑等都是治疗本病的有效药物,鉴于两性霉素B的毒副作用大,本例予以氟康唑与大蒜素联合治疗亦起到了较好的疗效。大多数患者抗真菌治疗7d后,体温即可下降,肝功等出现好转;若患者予抗真菌治疗7d后,症状缓解不明显,可将氟康唑换用伊曲康唑抗真菌治疗也能起到较好的疗效。抗真菌治疗的疗

调。我们通过荧光定量PCR对上述结果进行进一步

验证,也到相同的结论。在后续的实验中,我们将进一步验证在乙型肝炎患者的肝脏标本中是否也有类似microRNA的变化情况;在此基础之上,借助于生物信息学工具,预测这些差异表达microRNA的靶基因,并进行验证,以期阐明这些差异表达的microRNA在HBV致病过程中的作用。参考文献:

[1]BartelDP.microRNA:genomics,biogenesis,mechanism,andfunc2

tion[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[2]LewisBP,BurgeCB,BartelDP.Conservedseedpairing,often

flankedbyadenosines,indicatesthatthousandsofhumangenesaremi2croRNAtargets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[3]QiP,HanJX,LuYQ,etal.Virus2encodedmicroRNAs:futurether2

apeutictargets?[J].CellMolImmunol,2006,3(6):411-419.[4]CastoldiM,SchmidtS,BenesV,etal.AsensitivearrayformicroR2

NAexpressionprofiling(miChip)basedonlockednucleicacids(LNA)[J].RNA,2006,12(5):913-920.

[5]LivakKJ,SchmittgenTD.Analysisofrelativegeneexpressiondata

usingreal2timequantitativePCRandthe2(2DeltaDeltaC(T))Meth2od[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[6]LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronic

genelin24encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin214[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[7]Griffiths2JonesS,GrocockRJ,van2DongenS,etal.miRBase:mi2

croRNAsequences,targetsandgenenomenclature[J].NucleicAcidsRes,2006,34(Databaseissue):D140-D144.

[8]孙建国,廖荣霞,陈正堂,等.小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细

胞中的转染与表达[J].第三军医大学学报,2005,27(3):196-199.

(编辑 栾 嘉)

程较长,本例患者给予氟康唑400mg/d静脉滴注,抗真菌治疗

20d后,改为口服三维康200mg/d,口服2个月后停药,患者症

状完全缓解,实验室指标正常,病情未反复,故抗真菌治疗疗程一定要足够,一般为2~3个月。  关键词:播散型;组织;胞浆菌病

  中图法分类号:R519.8   文献标识码:B

参考文献:

[1]陈建斌,韩 凤,潘 建,等.7例播散型组织胞浆菌病临床分析

[J].重庆医科大学学报,2005,30(2):318-319

[2]任在跃,吴 涛,刘爱民,等.播散型组织胞浆菌病1例[J].西

部医学,2004,16(3):211.

(编辑 栾 嘉)

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