姜黄素对肝纤维化大鼠中自噬相关蛋白作用的观察

姜黄素对肝纤维化大鼠中自噬相关蛋白作用的观察

目的观察姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织中自噬相关蛋白（Beclin1、Atg5）表达的影响，探讨姜黄素介导的自噬对肝纤维化的影响，从自噬的视角探讨姜黄素治疗肝纤维化的作用机制。方法40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（10只）、模型组（15只）、姜黄素组（15只），正常组正常饲养8周，不予处理，模型组及姜黄素组予腹腔注射四氯化碳溶液，剂量为1 ml/kg，每周3次，共8周，同时姜黄素组按照每100 g体质量给予20 mg姜黄素灌胃，每周3次，共8周。第8周末处死大鼠，留取新鲜肝组织制作蜡块，免疫组织化学链亲和素-酶复合物-生物素技术（SP法）检测各组大鼠肝组织Beclin1、Atg5的表达并进行比较。结果模型组及姜黄素组较正常对照组Beclin1、Atg5表达增多，而姜黄素组中Beclin1、Atg5表达较模型组减弱（P均75%均评为4分。对每个视野进行染色强度的评分与阳性细胞百分比的评分，评分结果以染色强度与阳性细胞百分比的乘积表示：0分为阴性，1～6分为弱阳性，7～12分为强阳性。

三、统计学处理

应用SPSS 19.0分析数据，正态分布数据采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、3组大鼠肝組织中Beclin1、Atg5的阳性表达结果

显微镜下Beclin1的阳性表达呈棕黄色或棕褐色，主要表达于肝细胞胞浆。正常对照组Beclin1表达呈棕黄色，表达面积小；模型组胞浆可见大量的Beclin1表达，呈棕褐色，表达面积大；姜黄素组可见Beclin1表达呈棕黄色，表达面积较模型组减少，颜色也较浅，但较正常组表达面积增大，颜色也较深，见图1。显微镜下Atg5的阳性表达呈棕黄色或棕褐色，主要表达于肝细胞胞浆。正常对照组Atg5表达呈棕黄色，表达面积小；模型组胞浆可见大量的Atg5表达，呈棕褐色，表达面积大；姜黄素组可见Atg5表达呈棕黄色，表达面积较模型组减少，颜色也较浅，但较正常组表达面积增大，颜色也较深，见图2。

二、3组大鼠肝组织中Beclin1、Atg5的表达结果比较

模型组及姜黄素组较正常对照组Beclin1（P＜0.001及P=0.029）、Atg5（P＜0.001及P=0.010）表达增多，而姜黄素治疗组中Beclin1、Atg5表达较模型组减弱（P=0.003及P=0.001），见表1。

讨论

肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化的必经病理阶段，激活的HSC在肝纤维化发生发展中起重要作用[5]。自噬是细胞进化过程中高度保守的基因调控程序，

是一种溶酶体依赖途径的降解过剩的蛋白质和受损的细胞器的过程。国外学者发现在正常肝脏中自噬溶酶体中的酶活性非常低，生理条件下肝细胞低水平自噬维持着肝脏正常的代谢功能[6-7]。各种肝脏损伤（如酒精的消耗、四氯化碳等毒物）已经被证实能诱导自噬水平升高[8]。自噬过程由多种重要的蛋白通过磷酸化与去磷酸化进行调控，其中Beclin1、Atg5参与了自噬的启动和延伸阶段，是调控自噬的关键基因。Beclin1又称为BECN1，是首个被发现具有调节自噬的相关基因，它是Atg6基因的同源产物，编码一种分子量为60 ku的蛋白。目前，人们普遍认为Beclin1是调控自噬的一种关键蛋白，作为自噬启动过程中的关键蛋白，Beclin1是最被广泛应用于研究自噬的自噬分子标记物之一。Atg5是参与自噬体形成的重要基因，Atg5通常是以与Atg12结合形成复合物的形式存在，在一些真核细胞中，几乎所有的Atg5和Atg12都以结合成复合物的形式存在。Atg5-Atg12复合物在自噬体膜的延伸阶段起着关键的作用。据报道，在动物模型中敲除Atg5能使自噬水平下降，发生基因突变的 Atg5不能与Atg12结合成复合物，从而阻止自噬体的形成[9]。因此，Atg5 也是调控细胞自噬的一个关键基因，是被广泛应用于研究自噬的自噬分子标记物。在本实验中四氯化碳作为一种造成肝损伤的毒性物质，在造成肝损伤的同时也能诱导细胞自噬来参与肝纤维化的进程，国外学者发现自噬为HSC的活化提供能量支持[10]。因此认为自噬促进了HSC活化从而参与了肝纤维化的形成。Thoen等（2011年）用特异性抑制剂抑制自噬或敲除自噬相关基因Atg的表达则ATP的水平明显降低、并能使活化的HSC转为静息型。Hernndez-Gea等[11]用四氯化碳制作小鼠肝纤维化模型，并利用特性性自噬抑制剂或敲除自噬相关基因阻断HSC的自噬，结果发现肝纤维化模型小鼠自噬水平明显升高，阻断鼠HSC的自噬则减少了肝纤维化的形成和细胞外基质的沉积。由此，肝星状细胞中自噬的激活在肝纤维形成中至关重要，选择性地抑制HSC的自噬或许可用于治疗肝纤维化。

抗肝纤维化的实验研究已经取得很大进展，很多药物在啮齿动物研究中被证明抗肝纤维化是有效的[12]。本研究小组既往研究已经证实姜黄素具有预防和治疗肝纤维化的作用，并探讨了其有关作用机制[13-14]。本实验是结合以往系列研究成果，用姜黄素作用于肝纤维化大鼠模型，观察姜黄素的抗肝纤维化作用及自噬相关蛋白表达，进一步探索姜黄素抗肝纤维化的作用机制。结果显示，模型组及姜黄素组较正常对照组Beclin1、Atg5表达明显增多，再次证实肝纤维化模型中自噬水平升高，而姜黄素治疗组中Beclin1、Atg5表达明显较模型组减弱，说明姜黄素在肝纤维化动物模型中能明显减少Beclin1、Atg5的表达，降低自噬水平。本实验在前期研究基础上进一步证实了姜黄素具有抑制HSC活化的作用，其机制可能与其抑制Beclin1、Atg5的表达有关，姜黄素可能通过抑制自噬来抑制HSC活化从而延缓肝纤维化的进展。

本研究从细胞自噬这一新的视角探讨姜黄素治疗肝纤维化的机制，为姜黄素治疗肝纤维化的临床应用提供了进一步的证据支持，拓宽了肝纤维化治疗的视野，为临床肝纤维化治疗研究提供新思路和潜在治疗靶点。

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