***含量测定
方法学确认方案
日期：2016年1月
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验证方案审查与批准
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姓 名 起草人 职 务 签 名 日 期 姓 名 审核人 审核人 职 务 签 名 日 期 姓 名 批准人 职 务 签 名 日 期 来源于网络
目 录
1. 目的 ...................................................... 错误！未指定书签。 2. 范围 ...................................................... 错误！未指定书签。 3. 验证机构与职责 ............................................ 错误！未指定书签。 4. 定义 ...................................................... 错误！未指定书签。 5. 参考文件 .................................................. 错误！未指定书签。 6. 风险因素分析 .............................................. 错误！未指定书签。 7. 验证准备 .................................................. 错误！未指定书签。 8. 检测方法的描述 ............................................ 错误！未指定书签。 9. 验证实施 .................................................. 错误！未指定书签。 10. 偏差与变更 .............................................. 错误！未指定书签。 11. 确认结果评定与结论 ...................................... 错误！未指定书签。 12. 确认周期 ................................................ 错误！未指定书签。 13. 附录目录 ................................................ 错误！未指定书签。
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1 目的
对苦参膜中的含量测定检测方法进行确认，确保方法的可行性，以便为有效控制苦参膜的含量提供依据。 2 范围
本方案适用于*****药业股份有限公司齐墩果酸片含量测定方法的确认。 3 验证机构与职责 3.1验证小组成员 姓 名 所在部门 在验证中担任职务 组长 组员 组员 签名 日期 3.2 职责 3.2.1 验证小组组长职责 3.2.1.1 保证确认方案及各种检查表的起草。 3.2.1.2 保证在执行前完成对确认方案及各种检查表的审核和批准。 3.2.1.3 负责对确认小组成员进行本方案的培训。 3.2.1.4 保证完全按照确认方案实施。 3.2.1.5 确保能及时发现偏差，并按照已经达成一致的偏差处理方法对其进行记录、纠正、调查和最终确认。 3.2.1.6 确保确认报告的生成、审核和批准。 3.2.2 QA职责
3.2.2.1 执行前完成对确认方案及各种检查表的审核。
3.2.2.2 负责确认过程的监控和检查，保证确认方案的实施，参与确认结果评价。 3.2.2.3 参与确认偏差的调查、处理、和评估。
3.2.2.4 确认过程中，如有变更，保证按《变更处理程序》执行。 3.2.3 其它成员职责
3.2.3.1 执行前确认确认方案已批准，并经过培训。
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3.2.3.2 按确认方案实施确认，收集、整理确认数据，完成确认记录和报告。 3.2.3.3 参与确认偏差的调查和处理，确认通过偏差修订和解决方案。 3.2.3.4 确认确认过程中的变更在实施前已经批准。 4 定义
4.1 线性：指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。
4.2 准确度：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。 4.3 重复性：再规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价。 4.4 中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员或用不同设备测定结果之间的精密度， 称为中间精密度。 5 参考文件 5.1 药品生产质量管理规范（2010年修订版） 5.2 药品生产验证指南 5.3 中国药典（2015年版）二部 5.4《国家药品监督管理局国家药品标准》 5.5 公司相关文件： 5.5.1 苦参膜质量标准及检验规程（） 5.5.2 验证管理（） 5.5.3 变更控制操作规程（） 5.5.4 偏差处理操作程序（） 5.5.5 纠正措施与预防措施操作规程（） 5.5.6 2016年度验证总计划 6 风险因素分析
风险评估将采用失效模式及影响（FMEA）的工具来评估和衡量方法参数失效后对产品分析结果的影响。评估过程将参照公司质量风险管理的要求，风险等级为低、中、高级别的必须给出合理的建议措施，之后再次对建议的风险控制措施进行评估以确保风险的降低，分析、评估结果见附录1《风险评估表》。 7 验证准备
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7.1 确保所有方法SOP是最新版本且经过批准，将检查结果记录在附录2《文件检查》内。 7.2 确认参与验证的人员都经过此方案和相关SOP的培训，和识别所有签字和草签本方案任何数据表的人员。将检查结果记录在附录3《培训检查和签名确认》内。
7.3 确认验证过程中用到设备、计量仪器都是经过校验，并在有效期内，将检查结果记录在附录4《确认用仪器/仪表校准检查》内。 8 检测方法的描述 8.1 药品与试剂的准备 ***对照品（中国药品生物制品检定院提供），***（为*****药业股份有限公司生产）；硅钨酸试液、碘化汞钾试液、苦味酸、氯仿、甲醇、浓氨、稀碘化铋钾试液、盐酸液（0.2mol/L）、氢氧化钠液（1mol/L）、氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）、硫酸滴定液（0.05mol/L）、甲基红示液、磷酸、乙腈、无水乙醇。 8.2 仪器分析条件 电子天平（FA2014）、超声池（KQ-300DE）、电热恒温水浴锅（DK-98-1）、高效液相（LC-10ATVP) 8.3 检测方法 显色鉴别、色谱鉴别、酸碱滴定法、高效液相色谱法 8.4 检测操作 ：样品连续三批，A、B两位组员各取样品1号、样品2号约0.15g，分置三支试管中，加水2ml使溶解，分别加硅钨酸试液、碘化汞钾试液及苦味酸试液1～2滴，分别生成白色、淡黄色及黄色沉淀。
薄层鉴别：样品连续三批，A、B两位组员分别取本品0.1g，加甲醇10ml使溶解，超声提取15分钟，静置，取上清液作为供试品溶液；另取苦参碱及氧化苦参碱对照品适量，加甲醇制成每1ml中各含5mg的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，取上述三种溶液各2～3μl，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（5:0.6:0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。
8.4.2.3酸碱滴定法：连续三批样品，两位组员分别取样品1、样品2，各10片，剪碎，取一片重两份，各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,
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每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。
本品每片含总生物碱以****80.0%～110.0%。相对偏差（dr%）不得超过0.6% 计算公式：
C1：硫酸滴定液的实际浓度（mol/L)； C2：硫酸滴定液的理论浓度（mol/L)； C3：氢氧化钠滴定液的实际浓度（mol/L)； C4：氢氧化钠滴定液的理论浓度（mol/L)； V1：加入硫酸滴定液的体积（ml)； V2：消耗氢氧化钠滴定液的体积(ml)； T ：标示量（26.44mg)； m ：该批20片苦参膜的平均重量(g)； M ：使用苦参膜的量（g)。 8.4.2 .4高效液相色谱法 色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合硅胶为填充剂：以乙腈-无水乙醇-3%磷 酸溶液（85:7.5:7.5）为流动相；柱温30℃，检测波长为220nm，流速1.0ml／min，理论塔板数按氧化苦参碱峰计算，应不低于5000。 6.2.2对照品溶液的制备： 取******对照品适量，精密称定，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液，摇匀，即得。 供试品溶液的制备： 取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。
6.2.4测定法： 分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相 色谱仪，测定，即得。
本品每片含******不得少于22.0 mg。相对标准偏差不得过2%。 计算公式:
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① AA1A2 2② Cmg/g样品峰面积对照品浓度稀释倍数样品平均片重
对照品平均峰面积样品称量 A: 对照品进两针的平均峰面积；
A1: 对照品第一针峰面积； A2: 对照品第二针峰面积。 9 验证实施 9.1线性实验 目的：在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度应符合规定。 9.1.1.1实验过程 同一人同时取同一批样品，各10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5，各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。 本品每片含总生物碱以氧化苦参碱(C15H24N2O)计，应为标示量的80.0%～110.0%。相对偏差（dr%）不得超过0.6%。 9.1.1.2 以样品滴定过程中消耗氢氧化钠的体积为横坐标，以样品含量为纵坐标，绘制回归方程。 9.1.1.3可接受标准（相关系数dr《0.6%）。
9.1.1.4 记录：将实验结果记录在《***滴定含量测定线性实验记录》内，见附录。
***一瓶精密称取置25ml容量瓶中、***对照品两瓶精密称取置50ml量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）溶解至刻度。分别精密量取氧化苦参碱0.5ml、苦参碱5ml；氧化苦参碱1ml、苦参碱10ml；氧化苦参碱2ml、苦参碱20ml，分别置25ml容量瓶中，加乙腈：无水乙醇（85:15）至刻度。既得。 取已剪碎的样品约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水
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浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。 测定法： 分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片****，不得少于22.0 mg。
4 以对照品的吸取量（峰面积）为横坐标，以样品含量（峰面积）为纵坐标，绘制回归方程 5可接受标准（相关系数RSD《2%）。
6 记录：将实验结果记录在《***高效含量测定线性实验记录》内，见附录5。 9.2重复性实验
目的：在规定范围内，取同一批次的样品品，用5个测定结果进行评价，得到的结果RSD应符合要求。
9.2.1.1实验过程 取同一批样品，10片，剪碎，取一片重样品1、样品2、样品3、样品4、样品5各精密称定，加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。 本品每片含总生物碱以****80.0%～110.0%。相对偏差（dr%）不得超过0.6%。 9.1.1.2可接受标准（相关系数dr《0.6%）。 9.1.1.3 记录：将实验结果记录在《***滴定含量测定重复性实验记录》内，见附录5。 9.2.2 高效 9.2.2 实验过程
对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液，摇匀，即得。
取同一批样品10片，剪碎并分别取样品1、样品2、样品3、样品4、样品5约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。
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测定法： 分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(C15H24N2O)与氧化苦参碱（C15H24N2O2）的总量计，不得少于22.0 mg。
4可接受标准（相关系数RSD《2%）。
5 记录：将实验结果记录在《***高效含量测定重复性实验记录》内，见附录5。 9.3 中间精密度实验
9.3.1 目的：含量测定中，一个实验室内不同的人、在不同时间（通常是不同天）测定得到的结果RSD应符合要求。 9.3.1 滴定含量 9.3.1.1 实验过程 9.3.1.2 两名实验人员分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g），加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。 9.3.1.3 可接受标准（同一人实验结果RSD%≤2.0%；两人间的RSD%≤2.0%） 记录：将实验结果记录在《***滴定含量测定中间精密实验记录》内，见附录5。 两名实验人员用同一批对照品分别在不同时间（通常是不同天）各取同一批号苦参膜10片，精密称定，剪碎，各精密称取本品3份（每份约0.6g），置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。
测定法： 分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品每片含苦参总碱以苦参碱(C15H24N2O)与氧化苦参碱（C15H24N2O2）的总量计，不得少于22.0 mg。
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9.3.2.3可接受标准（同一人实验结果RSD%≤2.0%；两人间的RSD%≤2.0%）。
9.3.2.4记录：将实验结果记录在《***高效含量测定中间精密度实验记录》内，见附5。 9.4 含量测定准确度实验
9.4.1 目的：含量测定中，用已确定的方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示，得到的结果RSD应符合要求。 9.4.2 实验过程
精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约0.6g），分别置于圆底烧瓶中，分成三组，分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品2 ml；向第二组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品5ml；向第三组的每一份供试品中加入浓度为（35μg/ml）的氧化苦参碱对照品7 ml。加氯仿25ml回流3次，每次1小时，合并提取液，置水浴上挥干，残渣用0.2mol/L盐酸液5ml使溶解，滤过，滤液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化钠约6g与1mol/L氢氧化钠液5ml,摇匀，用三氯甲烷振摇提取5次（25、20、10、10、10ml）,每次三氯甲烷提取液均用同一饱和氯化钠液5ml振摇洗涤，再依次分别通过同一装有无水硫酸钠1g的脱脂棉层滤过。合并三氯甲烷液，精密加硫酸滴定液（0.05mol/L）10ml及新沸过的冷水20ml，振摇提取后，分取酸层，氯仿层再用新沸过的冷水洗涤3次，每次10ml，合并酸液与洗涤液，置水浴上加热，除去残留的三氯甲烷，放冷至室温，加甲基红指示液2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的硫酸液（0.05mol/L）相当于26.44mg的C15H24N2O2。 1 测定法 将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。 2 可接受标准（实验结果回收率98.0%～102.0%）。 记录：将实验结果记录在《***滴定含量测定准确度实验记录》内，见附录8。
9.4.3.1 对照品制备：对照品溶液的制备： 取苦参碱、氧化苦参碱对照品母液适量，置同一量瓶中，加乙腈-无水乙醇（85:15）制成每1ml含苦参碱0.32mg和35μg的溶液，摇匀，即得。 9.4.3.2 供试品制备：
精密称取同一已知含量的供试品9份（每份约0.6g），置具塞锥形瓶中，加浓氨水0.5ml，精密加入三氯甲烷25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，加三氯甲烷补足损失重量，滤过，精密吸取续滤液5ml，水浴上挥干，用乙腈-无水乙醇（85:15）定溶至25ml量瓶中，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。分成三组（每组3份样品），分别向第一组的每一份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品2 ml；向第二组的每一份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品5ml；向第三组的每一
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份供试品中加入浓度为（每1ml含苦参碱0.32mg和氧化苦参碱35μg的溶液）的对照品7 ml。分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液5～10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。 将测得的总含量减去供试品中已知含量，计算每组的回收率。 %～102.0%）。
记录：将实验结果记录在《***效含量测定准确度实验记录》内，见附录8。
10 偏差与变更 10.1 验证偏差
当该方案的某一部分无法实施或实际情况无法达到可接受标准时，需要进行偏差报告。当偏差出现时，首先要进行全面调查以确定该偏差是由什么引起的，之后再确定相应的解决措施。
将验证过程中产生的偏差记录在《偏差处理单》中，并作为验证记录附件。 10.2
变更控制 所有在验证过程中产生的变更都需记录，确保所有的变更得到评估和批准，验证的结果达到预定的目的和要求。 将验证过程中产生的变更记录在《变更处理单》记录中，并作为验证记录附件。 11 确认结果评定与结论 11.1 验证小组负责对确认结果进行综合评审，做出确认结论。 11.2 对确认结果的评审应包括： 11.2.1 确认实施是否有遗漏？ 11.2.2 确认实施过程中对确认方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？ 11.2.3 确认记录是否完整？ 11.2.4 确认试验结果是否符合标准要求？是否需要进一步补充试验？ 12 附录目录 附录1 风险评估报告 附录2 文件检查
附录3 培训检查和签名确认 附录4 确认用仪器/仪表校准检查 附录5 ***滴定含量测定操作记录 附录5 ***高效含量测定操作记录
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