提取大豆异黄酮糖苷和苷元并比较其免疫
能力的强弱
实验设计
南方医科大学 第二临床医学院
10级临床医学院（妇幼保健）石惠卿 10级临床医学院（妇幼保健）罗玉云 10级临床医学院（妇幼保健）林冬华 10级临床医学院（妇幼保健）彭书杰 10级临床医学院（妇幼保健）刘颖慧
摘要
大豆异黄酮是一种生理活性物质，更是人体生理生化中不可缺少的成分，它对调节人体新陈代谢，预防中老年疾病有一定的意义。 研究和开发含有大豆异黄酮的各种新产品，不仅可以提高大豆的附加值，而且可创造出乐观的经济效益，经调查，市场对大豆异黄酮的年需求量在1500吨，而目前的年产量为500吨。因此大豆异黄酮的研究与开发就有很大的市场潜力。本次试验着重于异黄酮糖苷和苷元的提取，及其在免疫功能上的差异的研究。
关键词：大豆，异黄酮糖苷，异黄酮苷元，免疫
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1.前言………………………………………………………………………………2 2.实验目的…………………………………………………………………………3 3.实验原理…………………………………………………………………………4 4.实验器材与试剂…………………………………………………………………5 5.实验步骤…………………………………………………………………………6 6.结果预测及分析………………………………………………………………………8 7.可行性评估…………………………………………………………8 8.注意事项…………………………………………………………………………9 9.参考文献…………………………………………………………………………9
1.前言
大豆是豆科植物的成熟种子，大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，其结构与雌激素相似，是一类植物雌激素。大豆异黄酮有很多方面的药理活性，包括抗癌预防和治疗心血管疾病，预防和治疗骨质疏松和更年期综合症以及免疫调节作用。经研究发现，大豆异黄酮主要在肠道被吸收，吸收率为10%~40%。目前对大豆异黄酮 功效 性质的研究报道很多，但关于大豆异黄酮糖苷和苷元免疫功能对比实验研究尚少，为明确大豆异黄酮糖苷及其苷元组分 的生理作用 ，本次实验对比研究大豆异黄酮糖苷和苷元对小鼠体液免疫功能的影响 。
2.实验目的
2.1从大豆中提取异黄酮糖苷及苷元
2.2对大豆异黄酮糖苷及苷元进行定性鉴定 2.3对大豆异黄酮糖苷及苷元进行定量鉴定
2.4比较大豆异黄酮糖苷和异黄酮苷元 对小鼠血液中溶血素含量的影响
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2.5通过本实验，比较出异黄酮糖苷和异黄酮苷元免疫功能的大小，为进一步的研究提供参考。 3,实验原理:
3.1异黄酮糖苷及苷元的提取原理
异黄酮类化合物属于多酚类化合物，它的母体为3一苯基苯并毗哺酮.异黄酮类化合物常温下为固体，熔点在11℃以上，性质稳定，易于贮藏。易溶于有机溶剂如氯仿、二甲基甲酸胺、乙醇等，不溶于水、甲醇等极性溶剂。本次试验以大豆为原材料，制备异黄酮糖苷。 后用酸水解法 得异黄酮苷元。 3.2异黄酮糖苷及苷元的定性鉴定原理
异黄酮糖苷为含糖衍生物，所以可以发生molish反应，产生紫环。而异黄酮苷元为结合与糖的非糖部分，不会与molish反应。 3.3异黄酮糖苷及苷元对血液中溶血素的影响比较
异黄酮糖苷和异黄酮苷元 可促进小鼠分泌溶血素，以鸡红细胞悬液为免疫原进行免疫，鸡红细胞悬液可与小鼠体内的溶血素发生免疫反应，通过测定溶血素光密度值来推断糖苷和苷元的免疫功能强弱。 3.4小鼠粪便中糖苷和苷元含量的测定
通过测定小鼠粪便糖苷和苷元的含量，从而间接测出小鼠对糖苷和苷元的吸收多少来推断糖酐和甘愿的免疫功能强弱。 4实验器材与实剂 4.1实验器材
抽滤装置、索氏提取装置、烘箱、恒温水槽、旋转蒸发器、回流装置、分光光度计、电动搅拌器、温度计、小试管、试管夹、标签、锥形瓶、量筒、烧杯、蒸发皿、圆底烧瓶、石棉网、胶头滴管、铁架台、漏斗、玻璃棒、灌胃器、微量加量器、布氏漏斗、酒精灯、滤纸、棉花、棉签、高速冷冻离心机、制备型高效液相色谱分析仪、分析性高效液相色谱分析仪。 4．2实验材料及试剂
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材料：豆粉200g,活体小鼠12只，80%乙醇溶液，1mol/L盐酸溶液，乙酸乙酯，molish试剂，浓硫酸、50mmol/L醋酸钠缓冲液—甲醇—乙腈（体积比为40:40:20）混合液、流动相II为50mmol/L醋酸钠缓冲液（pH5）—甲醇（体积比为80：20）混合液、甲醇—水（体积比为30:70）混合液、甲醇—体积分数为0.1%的乙酸水溶液（体积比为23:77）、5%生理盐水鸡红细胞悬液、
生理盐水、补体溶液
4.3 5%生理盐水鸡红细胞悬液
配制方法：鸡血红细胞置于Alsever氏液中在4摄氏度下冰箱保存，临用前用生理盐水洗涤3次，配成5%混悬液即可。
补体溶液
配制方法：补体以2~3只豚鼠血清混合，用生理盐水配成10%。
5实验步骤
5.1从大豆中提取异黄酮糖苷
5.1.1称取200g粒度为20到60目的豆粉 置于烘箱中通风干燥32h,至其变为恒重。
5.1.2干燥后的豆粉进行索氏提取，去除残留油脂，直至回流液变为无色时将滤纸筒放入烘箱干燥。
5.1.3每次称量30g脱脂豆粉的样品加入80%乙醇溶液（原料与溶剂比1:20），在恒温水浴中回流恒速搅拌提取4h，对所得粗提液真空抽滤两遍，弃去滤渣。5.1.4收集的粗滤液在70摄氏度下旋转蒸发，除去大量的乙醇溶液，浓缩产物通风干燥转化为固体。
5.2
大豆异黄酮苷元的制备
5.2.1 称取200g粒度为20到60目的豆粉 置于烘箱中通风干燥32h,至其变为恒重。
5.2.2干燥后的豆粉进行索氏提取，去除残留油脂，直至回流液变为无色时将滤纸筒放入烘箱干燥。
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5.2.3每次称量30g脱脂豆粉的样品加入80%乙醇溶液（原料与溶剂比1:20），在恒温水浴中回流恒速搅拌提取4h，对所得粗提液真空抽滤两遍，弃去滤渣。5.2.4收集的粗滤液在70摄氏度下旋转蒸发，除去大量的乙醇溶液，浓缩产物通风干燥转化为固体。
5.2.5将异黄酮糖苷试样用六倍体积1mol/l盐酸溶液水解4小时，水解产物经乙酸乙酯提取，蒸馏，冷冻干燥，得大豆异黄酮苷元。
5.3 大豆异黄酮糖苷和异黄酮苷元的定性鉴定 5.3.1将大豆异黄酮糖苷和异黄酮苷元制成溶液。
5.3.2加两滴Molish试剂，摇匀。
5.3.3倾斜试管，沿试管壁小心加入1ml浓硫酸，勿摇动。 5.3.4小心竖直后观察两层液面交界处的颜色变化。 5.4 大豆异黄酮糖苷的定量鉴定
5.4.1制备色谱柱NovaPakHRC18(100mm*25mm i.d.,6um),流动相为甲醇—体积分数为0.1%的乙酸水溶液（体积比为23:77）
5.4.2操作仪器使流速为20Ml/min.检测波长为260nm,进样体积1ml. 5.4.3峰面积定量，外标法计算。 5.5 大豆异黄酮苷元的定量鉴定
5.5.1制备色谱柱NoPakHRC18(100mm*25mm i.d.6um),流动相为甲醇—体
积分数为0.2%的乙酸水溶液（体积比为81：19）
5.5.2操作仪器使流速为30Ml/min ,检测波长为260nm,进样体积1ml.
5.5.3峰面积定量，外标法计算。
5．6异黄酮糖苷及苷元对血液中溶血素的影响比较
5.6.1 随机取健康小鼠雌雄各6只。分为三组，一组为正常雌雄对照组，2组为
异黄酮糖苷雌雄组，3组为异黄酮苷元雌雄组。 剂量是40~100mg/kg,每组4只，按剂量连续灌胃21天，对照组灌胃等量生理盐水。
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5.6.2 所有组小鼠都要进行本试验，每只小鼠腹腔注射5%生理盐水鸡红细胞悬
液0.2ml进行免疫,免疫7天。
5.6.3摘眼球取血，室温下放置1h,用长针将凝血与管壁分离，使血清充分渗出。 5.6.4取血清用生理盐水稀释100倍，取稀释血清1ml,与5%鸡血红细胞悬液
0.5ml,10%补体0.5ml混合，在37摄氏度保温30min,0摄氏度下终止反应。
5.6.5离心后，取上清液于UV-1100型紫外可见分光光度计540nm处比色，记
录光密度值OD，另设不加血清空白对照，取其上清液作为比色时调“0”基准。以光密度值读数作为判断血清溶血素指标，比较各组差异。
5.6.6 分别收集对照组和实验组小鼠粪便烘干，恒重取10g,用色谱甲醇溶解，过
0.45um滤膜后，HPLC对粪便中大豆异黄酮糖苷和苷元进行检验。
试验检测方法
采用高效液相色谱法测定大豆异黄酮含量。
色谱条件：色谱柱HypersilODS2C18柱，250mm*4.6mmID,5um. 流动相：甲醇/水=40+60:柱温30摄氏度：流速1.0ml/min；
进样量：10ul:检测波长260nm分析时间35min/样品 以保留时间定性，峰面积定量，外标法计算。 5.7 小鼠粪便大豆异黄酮糖苷和异黄酮苷元残留含量测定 5.7.1分别收集各组小鼠粪便
5.7.2HPLC法测量大豆异黄酮糖苷小鼠组粪便中糖苷的含量 5.7.3HPLC法测量大豆异黄酮苷元小鼠组粪便中苷元的含量
6结果与分析
6.1对小鼠体液免疫功能的影响
按5.6步骤对实验组和对照组进行试验，结果见表1
组别 鼠数（只） 剂量 (ml/只) 光密度值（OD）(X+SD)
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苷元雌鼠 2 0.4 苷元雄鼠 2 0.4 糖苷雌鼠 2 0.4 糖苷雄鼠 2 0.4 空白雌鼠 2 0 空白雄鼠 2 0
6.2小鼠粪便中糖苷和苷元的测量
按照5.7步骤对实验组和对照组进行测量，结果如下：
组别
糖苷（mg）
苷元雌鼠 苷元雄鼠 糖苷雌鼠 糖苷雄鼠 空白雌鼠 空白雄鼠
6.3结果预测与讨论：
6.3.1若实验结果测得糖苷小鼠组的光密度值大于苷元小鼠组，且糖苷小鼠组的糖
苷排出量大于苷元小鼠组的苷元排出量，则糖苷的免疫功能强于糖苷。
6.3.2若实验结果测得糖苷小鼠组的光密度值大于苷元小鼠组，且糖苷小鼠组的糖
苷排出量小于苷元小鼠组的苷元排出量，则无法证明糖苷和苷元的免疫功能强弱。
6.3.3若实验结果测得糖苷小鼠组的光密度值小于苷元小鼠组，且糖苷小鼠组的糖
苷排出量大于苷元小鼠组的苷元排出量，则苷元的免疫功能强于糖苷。
6.3.4若实验结果测得糖苷小鼠组的光密度值小于苷元小鼠组，且糖苷小鼠组的糖
苷排出量小于苷元小鼠组的苷元排出量，则无法证明糖苷和苷元的免疫能力强弱。
—— —— —— ——
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苷元(mg)
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7．可行性报告
7.1 在实验5.4中，通过对小鼠溶血素光密度的测定以及对大豆异黄酮糖苷与大豆异黄酮苷元的吸收来比较大豆异黄酮糖苷与大豆异黄酮苷元在免疫功能上的差异。
7.3 本实验所用的小鼠数目有限，故忽略小鼠个体差异对实验所造成的影响。
7.4 由于本实验中大豆异黄酮苷元的制取是通过大豆异黄酮糖苷的水解所得，为节约时间，可一次性制得大量大豆异黄酮糖苷，以备后需。
7.5 本次实验只是从表面上去探讨大豆异黄酮糖苷与大豆异黄酮苷元免疫功能的差异，至于大豆异黄酮成分如何在体内作用，以及糖苷和苷元的进一步提取有待专家的进一步研究论证。
8注意事项
8.1 molish反应非常灵敏，0.001%葡萄糖和0,0001%蔗糖既能发生阳性反应，因此不可在样品中混入纸屑等杂物。
8.2对小鼠的管为何去学操作要快速准确。若小鼠挣扎，应调整姿势。 参考文献 【1】
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