09 生物技术
摘要：血液在体内承担着物质运输、免疫等重要的生理功能。比较不同动物的血液组成和血细胞的差异，对了了解血液的功能以及不同动物体的特征有重要意义。制作血涂片用于观察红细胞、白细胞、血小板形态；使用血细胞计数板于显微镜下直接计数，计算分别得到红细胞、白细胞数目。
关键字：血液 红细胞 白细胞 血细胞计数 血涂片
第一章 前言
血液在维持内环境稳定上起着重要作用，具有运输、缓冲、防御等功能。比较不同动物的血液组成和血细胞的差异，对了了解血液的功能以及不同动物体的特征有重要意义。
动物红细胞的形态、大小、数目与动物的进化和生态适应均有一定的关系，一般来说，动物越高等，红细胞的数目越多，而体积越小，同时血细胞也高度分化；白细胞体积（除鱼类）比红细胞大，但比重却比红细胞小。白细胞按其组成又分为粒细胞和无粒细胞。在不同生理状态下，白细胞数目波动较大。
通过观察不同脊椎动物的血涂片，并在镜下计数，即可初步观察到不同脊椎动物血细胞形态变化即数目变化。
第二章 材料与方法
2.1 血涂片的制作与观察
2.1.1 材料
鲤鱼、牛蛙、家鸽、家兔、小白鼠血液样品，洁净载玻片，毛吸管，瑞氏染液，蜡笔
2.1.2 方法
取末血样少量置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开，推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动，载片上保留下一薄层血膜。待干后用蜡笔在血膜两侧划线，以防染液溢出。然后将血膜平放在染色架上，加瑞氏染液2-3滴，使覆盖整个血膜。固定0.5-1.0分钟，滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水。与染料混匀染色5-10分钟。 当液面浮现一层金黄色金属状物质，表示染液起了作用。用蒸馏水冲去染液,待自然干燥后,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。
红细胞
淡红色，无核的圆形细胞，因红细胞为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。 颗粒白细胞
嗜中性颗粒白细胞：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1-5叶。直径10-12微米。
嗜酸性颗粒白细胞：略大于嗜中性白细胞，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。直径10-15微米。
嗜碱性颗粒白细胞：体积略小于嗜酸性白细胞，细胞质中有大小不等被染成紫色的颗粒，颗粒数目较嗜酸性白细胞的颗粒少，核1-2叶，染成淡蓝色。直径10-11微米。
淋巴细胞
胞质少，常为围绕细胞核的一薄层，其中无颗粒细胞核是肾形或马 蹄形，染成蓝紫色。
血小板
血小板体形甚小，形态不规则，染淡蓝色，内含紫色颗粒，无核，常聚集
成团。
2.2 血细胞计数
2.2.1 材料
鲤鱼、牛蛙、家鸽、家兔、小白鼠、人体血液样品，柠檬酸钠，血细胞计数板，盖玻片，毛吸管。
2.2.2 方法
1．计数原理：
血细胞计数板由一块长约7.5cm、宽3.5cm的厚玻璃制成，在中部1/3面积处有4条槽，内侧两条槽之间还有1条横槽相通，在中部构成2块长方形平台。此平台比整个载玻片平面低0.1mm。平台中部各有一个计数室，每个计数室分九大格，每格边长1mm，面积为1mm2，盖上盖玻片后体积为0.1mm3。四角的大格被划分为16个中方格，一般用作白细胞、血小板及组织培养的细胞计数。中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，盖上盖玻片后体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，用于红细胞、微生物细胞的计数。
计数方格为：
2.方法：
用毛吸管吸取10μl血液样本加柠檬酸钠至1ml（即稀释100倍）或2ml（即稀释200倍），轻轻摇匀。将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴、管将摇匀的血液稀释液由盖玻片边缘滴一小滴，让稀释液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，使计数室均能充满稀释液。取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生。
加样后静止2-3min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。 红细胞数/L=N*25/（5*10*106*稀释倍数） 白细胞计数/L=N*稀释倍数*10*106/4
第三章 结果
3.1血涂片的制作与观察
3.1.1 鲤鱼、牛蛙、家鸽的血涂片都只观察到了红细胞，经查阅相关资料，白细胞有如下特点：
1、含量少 由于白细胞含量为5000～10000个/立方毫米，而红细胞为400～500万个/立方毫米（男），其比例大约为1∶500（按最高含量），也即，大约观察500个红细胞才能看到1个白细胞。
2、颜色浅 白细胞体积比红细胞大，圆球形，是无色有核的细胞。因而，在光镜下观察，由于其透光能力强，所以看到的白细胞颜色浅。
主观因素 主要是来自于实验技能方面不过关。 解决方法：
可根据白细胞的透光能力较强这一特点，利用低倍镜找。方法是： 首先，应在低倍镜下调节细准焦螺旋，当看清细胞后，再继续向上调，使红细胞模糊不清。
然后，移动涂片，边移动边注意观察。会发现在视野中有一些小亮点，如星星在闪烁。将其中一个亮点置于视野中央，然后，再调细准焦螺旋使细胞清晰。观察后发现，此亮点便是要找的白细胞。如需仔细观察，可换高倍镜。但注意光线不要太亮。
3.1.2 家兔、小白鼠血涂片制作失败 血涂片制作失败原因分析： 1. 现象：
以磷酸缓冲液为稀释液配制染剂，配比尝试了1：5，1：7，1:9,细胞几乎均不着色；
以蒸馏水为稀释液配制染剂，配比为1：5，染色较浅，但能看到细胞。
查阅相关资料：缓冲液pH值为6.24时，各血涂片的血细胞染色均较淡，尤其是白细胞中特殊颗粒显示不清，胞核、胞质对比不理想；随
着缓冲液pH值的升高，血细胞染色逐渐变深，白细胞中的特殊颗粒逐渐显现，胞核、胞质对比逐渐鲜明；缓冲液pH值为6.98时，血细胞的染色、白细胞中特殊颗粒均显示清晰，胞核、胞质对比鲜明；随着pH值的继续升高，血细胞的染色、白细胞中的特殊颗粒显示反而模糊，胞核、胞质对比效果逐渐下降。
2.原因分析：
查阅相关文献：瑞氏染料是由伊红、美蓝的化合物溶于甲醇而制成的，伊红是带负电荷的酸性染料，美蓝是带正电和的碱性染料。两种染料结合在一起溶解在甲醇中后，美蓝和伊红又重新分离开来，成为带负电荷的伊红离子和带正电荷的美蓝离子，以吸附带不同电荷的蛋白质。
血细胞内含有不同等电点的蛋白质，在pH为6.98的缓冲液中，血液中的但多说蛋白质均达到或接近自己的等电点，因而能很好地吸附相应的染料并着色。
综上，家兔和小白鼠血涂片制作失败主要是由于没有测定染料的pH值，使得染色在不适宜的pH下进行不成功。
3.2 血细胞计数
3.2.1 鲤鱼血细胞计数（稀释二百倍） 1.红细胞
N=80，红细胞个数=0.8*1012个
2.白细胞无法辨识，具体误差分析见3.1.1
3.2.2 牛蛙血细胞计数（稀释二百倍）
14 15 18 17 16 1.红细胞
N=47，红细胞个数=0.47*1012个
2.白细胞无法辨识，具体误差分析见3.1.1
3.2.3 家鸽血细胞计数（稀释二百倍） 1.红细胞
N=299，红细胞个数=2.99*1012
2. 白细胞无法辨识，具体误差分析见3.1.1
3.2.4 家兔血细胞计数（稀释一百倍） 1.红细胞
N=909，红细胞个数=4.5*1012
181 184 178 181 185 50 69 67 58 55 8 9 9 10 11 2.白细胞
N=43，白细胞个数=11*109
3.2.5 小白鼠血细胞计数（稀释二百倍） 1.红细胞
N=829，红细胞个数=8.29*1012 2.白细胞
N=23，白细胞个数=11.5*109
8 5 4 6 149 181 168 155 176 6 14 10 13 3.2.6 人血细胞计数（稀释二百倍） 1.红细胞
N=336，红细胞个数=3.36*1012 2.白细胞
N=74,白细胞个数=37*109
20 21 16 17 75 67 68 57 69 3.3 数据汇总 数 动 物 值 红细胞 计数值 /(1012个/L) 理论值 /(1012个/L) 0.6-1.3 0.53 3.2 4.5-7 7.7-12.5 白细胞 计数值 /(109个/L) 未观察到 理论值 /(109个/L) 4.0 鲤鱼 牛蛙 家鸽 家兔 小白鼠 0.8 0.47 2.99 4.5 8.29 未观察到 14.7-21.9 未观察到 11 11.5 1.4-3.4 6-13 4-12 人
3.36 3.5-5.0 37 4-10 3.4 误差分析
误差来源既有技术上的，也有客观因素。
其中由于采血不顺利，器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误等因素所造成的误差属技术误差；而由于仪器（计数板、盖片、吸管等）不够准确与精密也会带来误差；还有由于细胞分布不均匀等因素带来的细胞计数误差。
查阅相关资料，可通过以下途径减小误差:
（1） 所用器材均应清洁干燥，计数板、血盖片、微量吸管及刻度吸管
的规格应符合要求或经过校正;
（2） 红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质微粒;
（3） 严格操作，从消毒、采血、稀释、充液到计数都应规范，尤其应
注意的是血样稀释及充液时既要作到充分混匀，又要防止剧烈震荡为破坏红细胞。必须一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的量以不超过计数室台面与血盖片之间的矩形边缘为宜;
（4） 欲将误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数
400个红细胞;
（5） 排除异常标本的干扰。
参考文献
[1] 杨秀平.动物生理学.高等教育出版社,2004. [2] 杨秀平.动物生理学实验指导.高等教育出版社,2004. [3] 解景田 赵静.生理学实验.高等教育出版社,2003.
[4] 包新康 张迎梅 高岚.动物生物学实验指导.兰州大学出版社，2008
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