实验五 等电点聚焦测蛋白质等电点

一、 实验原理

在稳定的pH梯度中，按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳的方法。蛋白质分子由于其表面电荷在稳定的pH梯度中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为零的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

二、 操作步骤

1 圆柱体凝胶制备，用封口膜将玻管的一端封口，将玻管套上橡胶塞，加入凝胶混合液至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，静置待其聚合（1hr）。 2 聚焦电泳

将电泳下槽注入0.2%硫酸600ml，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽【注意塞紧所有的孔，以防电极液漏下】。将上槽连同电泳管置于下槽上，此时凝胶下端与电极液接触，注意排除凝胶下表面的气泡。

上槽注入0.5%乙醇胺1000ml，注入注意不要搅拌样品层和隔离层。接上电源，正极接酸，负极接碱。恒定在160V至电流降至0（或不变）为止。

取胶 将聚胶后的含样品的凝胶借助长注射器针头注水取出。 加入2ml 10%三氯乙酸于10只小玻璃瓶中，将预测pH梯度的胶

条置于玻璃上，用刀片平分成10小段，按顺序放入有标号的小玻璃瓶中，盖好橡皮塞，将聚胶段在室温下浸泡过夜，次日用pH计测定每支小瓶中浸泡液pH值。将所得pH值对凝胶长度作图，得标准曲线。有条件时，应用已知等电点的标准蛋白做对照测等电点。

将剩下的样品胶用10%三氯乙酸固定，使胶里的蛋白质变性，几分钟后即可看见蛋白质条带。测定出染色蛋白带的位置，在pH梯度曲线上求出相应pH值即使此样品的pI。

三、 试剂

单体储液 1ml 10%过硫酸铵 0.02ml 水 2.73ml 两性电解质 0.15ml

样品液 0.05ml（浓度10mg/ml,BSA） TEMED 0.02ml

将以上试剂加入一支管内，再将每管内的胶平均装三支玻管，其中1-3号玻管里加入了牛血清蛋白50l，4-6号玻璃管加入了人血清蛋白100l，7-9号试管加入了牛血清蛋白50l和人血清蛋白100l，且其中加入的两性电解质为0.2 ml，其它条件与其它玻管保持一致。

四、 实验结果

各胶段pH（每段胶总长为9.5cm）

蛋白质 编号 牛血清蛋白 牛血清蛋白＋肌红蛋白 3.04 4.37 5.35 6.21 6.95 7.67 8.26 8.86 9.35 9.36 3.61 4.63 5.57 6.53 7.25 7.79 8.37 8.62 9.31 9.18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 以下实验所测数据均是从碱性端向酸性端所测胶段长度 玻管编号 1-3 10.3 9.3 4-6 9.3 7-9 9.7 9.6

总长（cm） 10.1 蛋白质位置(cm) 8.0 8.0 7.5 7.5 肌红蛋白 5.6 5.6 牛血清蛋白 7.9 7.8 牛血清蛋白胶条标准曲线

121086y = 0.6648x + 3.6127R2 = 0.95154200246810

肌红蛋白胶条标准曲线

1210864200246810y = 0.7411x + 3.07R2 = 0.962

使用第一个标准曲线计算蛋白等电点：pI牛血清蛋白=4.99，pI人血清蛋白=4.84 ，pI肌红蛋白=6.21