第39卷第4期 2014年4月 中国调噱昌 ChIna Condiment 专论综述 酱油中香气成分的提取和分析方法 刘婷,罗秀华,孙晶,高丽华 (北京食品科学研究院,北京100050) 摘要:酱油中的香气成分是评价酱油品质的重要指标。 阐述了常用的香气成分的分离、提取、分析方法,并介绍了酱油中香气成分提取、鉴定的研究进展。 关键词:香气成分分析;样品前处理;酱油 中图分类号:TS264.21 文献标志码:A doi:10.3969/j.issn.1000-9973.2014.04.035 文章编号:1000—9973(2014)04—0135—06 Extraction and Analysis Methods of Aroma Components in Soy Sauce LIU Ting,LUO Xiu-hua,SUN Jing,GAO Li-hua (Beijing Academy of Food Sciences,Beijing 100050,China) Abstract:The aroma components in soy sauce are the important indexes of evaluating the quality of soy sauce. The separation.extraction and analysis methods of aroma components are reviewed,and research progress of separation and determination of aronl ̄components in soy sauce are introduced in this paper. Key words:analysis of aroma components;pre-treating of samples;soy sauce 酿造酱油是以大豆、小麦为原料,经过微生物天然 发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品,是多种 氨基酸、糖类、芳香酯和食盐等的水溶液,色泽通常为 红褐色,有独特浓厚酱香气和酯香气,滋味鲜美,有助 于促进食欲,具有营养功效。酱油风味是由气味和味 道形成的一个错综复杂的系统,是构成酱油质量的重 提取方法和气相色谱质谱联用(GC/MS)、气相色谱嗅 觉检测技术(Gas Chromatography Olfactometry)等分 离技术的应用,综述了近年来酱油中挥发性香气成分 提取、分离、分析的研究进展。 1 香气物质的提取方法 目前香气成分的提取收集常采用蒸馏、萃取、同时蒸 馏萃取、超临界流体萃取、顶空气体捕集、固相微萃取等 要因素之一,而挥发性风味物质即香气成分决定其风 味和典型性,是评价酱油品质的重要指标。 通常酱油中香气成分的组成取决于酿造原料、生 产工艺和参与发酵的微生物等条件,但环境温度、光 照、压力和环境污染物等因素也会影响香气成分的组 成,并且酱油中的香气成分种类繁多,挥发性高,不稳 定,大部分含量较低,有些重要的香气物质的含量甚至 低于1 ng/Lc¨,且分散在以糖、蛋白、氨基酸、脂肪、盐 方法,其中萃取、顶空气体捕集、固相微萃取应用最广泛。 1.1 蒸馏法 1.1.1蒸汽蒸馏法(Vapor Distillation) 蒸汽蒸馏法是最简单直接的挥发性香气物质提取方 法,被广泛地单独使用或与其它样品制备方法联合使用。 在蒸馏器中,样品与水蒸气接触时,挥发性组分蒸气压和 和水为主要介质的混合物中,彼此之间存在动态平衡。 因此采用稳定性好、灵敏度高、高效的提取方法是分离 分析酱油中香气成分的关键。 本文阐述了常用的香气成分收集、提取方法的原 水蒸气压之和等于蒸气锅内压力,在沸腾时这部分挥发 性组分就能与水蒸气一起蒸馏出来。它与萃取结合建立 同时蒸馏萃取技术可以降低检出限和选择性。 1.1.2 同时蒸馏萃取法(simultaneous distillation- extraction,简称SDE) 理,分析了蒸馏法(蒸气蒸馏和同时蒸馏萃取)、顶空分 析技术(静态顶空、动态顶空和顶空固相微萃取技术)、 直接萃取方法(液液萃取、液固萃取和超临界萃取)等 收稿日期:2013—1O一08 *通讯作者 常压水蒸气蒸馏并同时萃取法,又称同时蒸馏萃取, 是用于香气全组分分析的方法,它是将蒸馏与萃取同时 作者简介:刘婷(1966一)。女,北京人,博士,高级工程师,研究方向:分析化学; 高丽华(1971一),女,北京,高级工程师,研究方向:食品科学。 一135— 第39卷第4期 2014年4月 中国调味品 China Condiment 专论综述 进行,设备简单,操作简便,集体影响小,并且使得香气物 质的提取率和回收率都较高。在加热的条件下,挥发性 香气物质随着水蒸气与萃取剂(乙醚)蒸气在密闭装置的 富集或浓缩物质,再加以分析。这种方法对香气的组分 和性质的影响较小。通常,顶空气体捕集分析方法与固 相微萃取结合使用可以降低检出限和选择性。 1.3萃取法 顶部混合并进行萃取,然后冷凝回流,这样反复进行可以 把1O 浓度级别的挥发性物质从脂质或水介质中浓缩数 千倍,也可以在10 浓度范围内对大多数有机物进行定 量提取,所以利用少量的样品和萃取剂就可以对其进行 1.3.1 液液萃取法(1iquid liquid extraction,简称u ) U 作为最经典的萃取方法因其操作中需要大量 高纯度的有机溶剂,对环境和健康造成危害已逐渐被其 分析。但是SDE法的整个过程是在高温密闭的环境条件 下进行,不适合在沸水温度下不稳定成分的提取,一些热 敏感性的香气成分会受热分解、水解或聚合,结构发生变 化,在一定程度上不能完全反应原料样品的香气特征,但 对一些热稳性的挥发性香气物质的分析,SDE法还是能 发挥它的积极作用。 1.1.3其他蒸馏法 他萃取方法所取代,但是仍然可应用于取得初步香气物 质的提取[2 ]。LLE利用待测组分与样品基体在互不 相溶的两相中溶解性差异进行分离,可用于挥发性有机 物、半挥发性有机物的提取,但是它的选择性强,复杂基 体易产生乳化或共萃取现象,为避免乳化,可采用连续 萃取,一般萃取后样品需要进一步纯化。 1.3.2 固相萃取技术(solid phase extraction,简称 ,E) 基于大气压蒸馏的样品制备方法不适用于食品样 品中香气成分的分离提取,因为较高的温度会使某些 固相萃取技术 是利用固体吸附剂将液体样品中 的目标化合物吸附,与样品的基体和干扰化合物分离, 物质发生降解等变化。真空直接蒸馏法即减压蒸馏萃 取法,它是将样品在低压条件下进行蒸馏,然后收集的 冷凝液利用重蒸乙醚进行萃取。由于此过程都是在较 然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附,达到分离和富集 目标化合物的目的,大大增强对分析物特别是痕量分 析物的检出能力,提高被测样品的回收率。固相萃取 低温度下进行,减少了高温对香气物质的影响,对醛类 和酸类有较高的萃取比例,提取的香气能较好的反应 是一个包括液相和固相的物理萃取过程,在固相萃取 中,固相对分离物的吸附力比溶解分离物的溶剂更大。 原料的香气特征,但对酯类香气的收集又十分低。由 于该方法对香气的提取率和回收率都较低,进行香气 物质的提取时需要大量的试样和试剂,而且它的样品 处理周期长,现在逐渐被其他方法所代替。 当样品溶液通过吸附剂床时,分离物浓缩在其表面,其 他样品成分通过吸附剂床;通过只吸附分离物而不吸 附其他样品成分的吸附剂,可以得到高纯度和浓缩的 分离物。它大大弥补了液液萃取法的缺陷,具有节省 1.2顶空气体捕集分析方法(headspaee analysis,简 称HS) 时间、溶剂用量少、不易乳化等优点,通用性强,易于自 动化。多种新型固相萃取的新方法包括固相微萃取 (SPME)、搅拌棒吸附萃取(SBSE)等。 1.3.2.1 固相微萃取法(solid phase microextrac— tion,简称SPME) 顶空气体捕集分析方法是直接对物质的挥发性成 分取样并联用气相色谱或气相色谱质谱分析的一种技 术,分为静态顶空分析法(static headspace,简称SHS) 和动态顶空(dynamic headspaee,简称DHS)分析法。 静态顶空分析法是将样品置于有一定顶端空间的密闭 容器中,通过加热密闭的容器,在一定的温度下两相达 到动态平衡后,直接吸取样品上方的气体进行分析分 离鉴定,它能很好的反映样品的香气特征,分析的香气 最接近原样品的香气特征,它操作简单,不需要繁琐冗 长的预处理,还能减少水、高沸点或非挥发性物质引起 SPME[7]是2O世际8O年代末在固相萃取基础上 发展起来的一种新型分离技术,一直被广泛应用于环 境工程、食品风味、临床和毒理研究。它是基于待分析 成分在光纤涂层上的吸收吸附,在食品研究领域其主 要用于风味物质和挥发性物质的分析。它是一个发展 最迅速的萃取技术,其优势在于简单、易于自动化、易 于与自动进样装置连接、光纤易被更换、装置价廉,与 的超载或污染,但该法收集到的香气量较少,灵敏度 低,从而限制了微量成分的检验。 其他手动技术不同,SPME重现性好。光纤涂层多种 多样,可以更换。例如,现在不仅有基于吸收机制的 PDMS,CW,PA光纤,基于吸附机制的DVB/PDMS, Carboxen/PDMS光纤。开发不同种类的涂层材料可 动态顶空分析法能够弥补静态顶空分析法的不足。 它是用惰性气体将密闭系统中顶端空间中与液相呈热力 学平衡的气体吹洗到富集系统中,利用多孔高聚物吸附 树脂对蒸气相中的待测香气组分进行吸附富集或浓缩, 应用于不同物质的萃取分离,应用最多的是Divinyl— benzene/Carboxene/Polydimethylsiloxane(DVB/ 然后用加热或利用溶液洗脱吸附物等适当的方法解吸此 一CAR/PDMS)涂层光纤。这种涂层的光纤对食品中的 136~ 第39卷第4期 中国调味品 China Condiment 专论综述 2014年4月 挥发性物质萃取效率较高,与顶空捕集联用可直接萃 取液相中的待分析物。 由于是食品基质的特殊性,存在大量糖类、脂类蛋 白质类、色素和其他非挥发物,SPME仅与顶空捕集联 用并应用于以下领域; 比较研究不同的水果和蔬菜; 食品中挥发性成分的划分, SPME与GC、GCMS、电子鼻联用进行微量成分 测定; 对食品质量重要的物质分析; 加工技术对风味物质的影响监测; 化学、生化、生物工程的监控; SPME应用于气相色谱嗅觉测量法(gas chroma— tography-olfactometry,简称GC-O)。 动态顶空固相微萃取法是一种新型的无溶剂样品 预处理技术,该技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体, 它通过吸附/脱吸附技术,富集样品中的挥发性和半挥 发性成分,克服了一些传统样品处理技术的缺点,至今 已广泛应用于挥发性和半挥发性有机物的分析,与 GCMS联用可快速分析出香气物质的组成。 1.3.2.2搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extrac— tion,简称SBSE) SBSE[8 是一种无溶剂或少溶剂,集萃取、净化、富 集为一体的样品前处理技术,一般是在内封磁芯的玻 璃管上涂覆一层聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsilox- ane,PDMS)或套上一定厚度的PDMS硅橡胶管制 成。萃取时搅拌棒在完成搅拌的同时吸附目标物,对 目标组分的富集倍数提高约100倍,因而更适合样品 中超痕量组分的分析。 1.3.3 超临界二氧化碳萃取法(supercritical CO2 fluid extraction,简称SFE) 超临界二氧化碳萃取法是利用CO,处于固/液/气 三相平衡超临界状态时,具有很强的提取自然产物的能 力,此种能力取决于压缩O 的压力和温度。在CO,处 于超临界的状态下,将其与待分离的物质接触,有选择性 地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取 出来。在萃取过程中可以通过控制压力来获取待分离物 中的不同组分,然后借助减压、升温的方法使超临界流体 变成普通气体,被萃取物质则完全或基本析出,然后再进 行其他的分析。它萃取出来的香气成分与原料中的几乎 完全相同,但它对设备的要求较高。 香气提取的方法各有利弊,每种方法的分析结果不 能完全的重叠,而是有一定的互补性,如果要进行香气的 全组分分析,有时要几种提取捕集方法同时进行。 2 酱油中香气成分的分析方法 日本是世界上较早研究酱油风味物质的国家,自 1966年以来就有对香气成分的研究报道。Nunamura 妇研究认为4-乙基愈创木酚是对酱油风味贡献最大的 化合物。Nunamura等[蝴以减压蒸馏法分离酱油风味成 分,并采用气相色谱质谱联用法鉴定出5O种化合物,并 阐明4-羟基一2(5)一乙基一5(2)-甲 ̄-3(2H)-呋喃酮和4-羟 基5_甲基3(2H)一呋哺酮是酱油风味物质中最重要的特 征组分。之后,Nunamura “]为进一步深入地研究将酱 油的风味成分划分为三部分:中性部分、酸性部分和碱性 部分,结果在碱性、酸性及中性部分中分别鉴定出35种、 93种及142种化合物,共计270种化合物,其中酸性部分 对酱油风味成分影响最大,以4-羟基一2(5)-乙基一5(2)-甲 基3(2H)-呋喃酮为最重要的成分。LjTlg等[1。]研究证明 酱油发酵中传统原料和压制原料中挥发性化合物组成相 似,37种香气成分包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、烃 类、酚类、吡嗪类和呋喃类,并且酱油发酵压制原料中醇 类和酸类含量高于其相应的传统原料中的含量。Wana- khachornkr ̄cn]等采用动态顶空进样法Cdynamic head- space sampling(DHS)]、直接溶剂萃取法Cdirect solvem extraction(Ⅸ、E)]、真空同时蒸汽蒸馏溶剂萃取法Cvacu- UlTI simultaneous steam distillation-solvent extraction(V- SDE)3对两种泰式酱油中的挥发性成分进行了富集提取, 然后用GCMS技术进行分析。结果显示2种品牌中香气 成分组成不同,3种提取方法能够提取到一些共同的成 分,但是高挥发性香气成分只能被动态顶空萃取提取到, 直接溶剂法和真空同时蒸馏萃取提取出的香气成分范围 非常广泛。Baek等Ⅱ 建立了一种基于样品稀释技术的 新的固相萃取气相色谱嗅觉测量法Csolid phase mieroex- traction-gas chromatography-olfactometry(SPME-GC-O) Methodology ̄,该方法可应用于酱油类液体食品中挥发性 提取物的测定。Kaneko等[1钉采用芳香物质萃取样品稀 释分析技术Caroma extract idlution analysis( 亚IA)tech- nique ̄研究了5种日本酱油中香气成分的组成和含量。 首次鉴别出2_乙基一1,3.环戊烷二酮和邻氨基苯乙酮两种 物质,而5种酱油中均含有甲硫基丙醛和3-羟基一4,5-二 甲基一2(5H)呋喃酮。Meng等[16]在4类日式酱油中和相 应加热的酱油中首次鉴别出3种挥发性硫醇化合物,具有 烤炙的咖啡香气的2-硫代呋喃甲醇、有焦臭味的苯甲硫 醇和具有热带水果味的2-巯基丙酸乙酯。Hayase等[17] 采用溶剂蒸馏提取法结合GC/GCMS分析了酱油调味品 烹饪时产生的香气成分,共检出73种有气味的物质,许多 挥发性成分具有烤炙味、烟熏味、酸味和甜味。Feng[珀 等 应用气相色谱嗅觉检测技术(gas chromatography olfac- 一1 37— 第39卷第4期 中国调味品 China Condiment 专论综述 2014年4月 tometry)研究了日式麸曲发酵酱油中香气成分的产生和 变化,对影响日式麸曲发酵酱油中香气成分的关键因素 进行了评估,证明醛类和醇类物质是日式麸曲发酵酱油 中主要香气物质,其中1一辛烯-3-醇、3-辛醇、辛烯醛、 柏 木萜烯、苯乙醛和3.甲硫基丙醛含量最丰富。I ̄neko 等[1妇采用芳香物质萃取样品稀释分析技术研究证实日式 酱油和其相应加热处理的酱油中含4O种主要的香气成 分,其中7种为新发现的芳香物质。在原料酱油中2_乙 基4一羟基5一甲基3(2H)-呋喃酮和4,5--"甲基3-羟基2, 5-二氢呋哺-2-酮的风味稀释因子最高,3-(甲硫基)丙醛、 4_乙基2-甲氧基苯酚(愈创木酚)和4-羟基2,5-二甲基3 (2H)呋喃酮的次之。Aishima等口叼采用偏最dx-乘回归 分析(PLS Regression Analysis)法比较了酱油风味物质的 GCMS测定结果和电子鼻测定结果的相关性,发现两种 方法得出的结果并不一致。Zhang等E ]分析了5种固态 发酵酱油中的游离氨基酸和挥发性芳香物质,用以了解 酱油味道和风味的变化,共鉴别出82种挥发性物质,包括 醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、酚类、杂环化合物、炔类和苯 系物,并认为酱油淡淡的香气不仅仅是取决于一种独特 的关键性物质而且取决于多种挥发性成分的临界平衡或 者说是综合效应。Sun等[2。]采用顶空固相微萃取(head- space solid rnicroextraction)结合GCMS技术(HS-SPME- GCMS)研究了12种品牌高盐稀态发酵酱油中挥发性化 合物的组成。对萃取温度和时间进行了优化,在2种品 牌酱油中共鉴别出8O种挥发性组分,其中有34种相同的 香气成分,醇类和酸类是酱油中的主要香气成分,例如醇 类物质主要是乙醇、2/3甲基丁醇和苯乙基醇,酸类物质 主要是乙酸、丁酸和3一甲基丁酸,其次各种各样的酯、呋 喃、酚类也是酱油挥发性香气成分的重要的组成部分。 Lertsiri等Ez3]采用芳香物质萃取样品稀释分析法和动态 顶空进样法结合C-C/l ̄S和气相色谱嗅觉检测技术研究 了18种泰式酱油风味物质中的挥发性香气组分。结果 证实二甲基丙醛、正丙醇、3-甲基1一丁醇、2,6-二甲基吡 嗪、3一甲基丁酸异戊酸异缬草酸、甲氧苯酚、3_羟基2-甲 基一4H-吡喃酮和4_羟基一2,5--"甲基一3(2H)一呋喃酮是泰 式酱油中关键的香气成分。Gao等口 采用固相萃取法和 GC/MS技术研究了中式酱油在高盐稀发酵酱油工艺(发 酵过程时间长达150天)各流程及其加热处理过程中挥发 性香气成分的变化。证实鉴别出76种挥发性香气成分, 其中大多数成分相同,在150天的发酵过程中酸、醇、酯、 醛、酮、呋喃类物质含量变化较大,同时比较了发酵期为 150天的酱油在8O℃下分别加热3O min和60 min后风 味物质的变化。Gao等【25]还测定了米曲霉麸曲发酵和混 合麸曲发酵的酱油中的游离氨基酸、水溶性多肽和香气 一】38一 成分含量。LEE等[26]用溶剂提取法和固相微萃取对发酵 酱油和酸水解酱油挥发性成分进行了富集,分析证明醇 类和酯类是发酵酱油中的主要成分,而杂环类化合物,如 吡嗪和呋喃以及酸类是酸水解酱油中的主要成分。国内 还有一些学者采用CH。C12、无水乙醚、同时蒸馏萃取、固 相微萃取等方法提取酱油中风味成分,GC/MS分离鉴定 其化学组成,但是单一的前处理方法并不能很好地完全 反应酱油中的挥发性香气成分的组成。高献礼采用固相 微萃取、同时蒸馏萃取和直接溶剂萃取法对高盐稀态酱 油挥发性风味物质进行提取浓缩,并利用气质联用进行 鉴定,共鉴定出140多种挥发性化合物,主要挥发性香气 化合物为酯、酸、醛、杂环化合物和醇类,其中酯类化合物 的数量和相对含量最多,此外有16种日式和韩式酱油中 的关键风味化合物在国产高盐稀态酱油中被检出。另外 也有学者研究了酿造酱油和酸水解酱油中挥发性成分的 差异、对酱油香精和焦糖中的挥发性成分进行了分析,在 5种酱油香精中检测出56种挥发性组分,共有组分14 个,并认为乙酰丙酸乙酯、乙酸苯乙酯和甲基环戊烯醇酮 可作为酱油香精存在的特征提示物。高献礼[2 采用固相 微萃取、同时蒸馏萃取和直接溶剂萃取法对高盐稀态酱 油挥发性风味物质进行提取浓缩,并利用气质联用进行 鉴定,共鉴定出140多种挥发性化合物,主要挥发性香气 化合物为酯、酸、醛、杂环化合物和醇类,其中酯类化合物 的数量和相对含量最多,此外有16种日式和韩式酱油中 的关键风味化合物在国产高盐稀态酱油中被检出。另 外,也有学 嘲研究了酿造酱油和酸水解酱油中挥发性 成分的差异、对酱油香精和焦糖中的挥发性成分进行了 分析,在5种酱油香精中检测出56种挥发性组分,共有组 分14个,并认为乙酰丙酸乙酯、乙酸苯乙酯和甲基环戊烯 醇酮可作为酱油香精存在的特征提示物。酱油香气成分 分析中使用的前处理方法见表1。 表1酱油香气成分分析中使用的前处理方法 (1990年至2013年SCI文献总结) 序号 分析物 前处理方法 分析方法参考文献 第39卷第4期 中国ChIna Condiment 调味品 专论综述 2014年4月 续哀 3 结语 综上所述,在任何一个样品的分析中,选择合适的 前处理方法是得到准确和可靠的测定结果的关键因 素。由于酱油产品中的香气成分包括了脂肪烃、芳香 烃、醇、酚、醛、酮、有机酸、酯、胺、吡嗪类等物质,含量 低,彼此之间存在热力学和化学动态平衡,因而选择这 些挥发性风味物质的分离富集方法,同时对相应的操 作参数进行优化非常重要。 一些经典和常规的提取技术如蒸馏法、U 和sPlE 仍然常用于酱油产品中香气成分的提取中,但正被一些 更有利于微量和痕量挥发性物质捕集的技术渐渐取代。 技术上最先进的,也是目前达到最高水准的挥发性物质 提取技术HS- ̄ME在酱油产品香气成分的分析中被越 来越多的应用。尽管相对其他方法其设备较昂贵,然而 它是能全面真实反映其挥发性风味物质的技术方法。也 许是酱油产品基质复杂,S已随方法尽管在酒类和果汁等 液体食品以及食醋[3o]香气成分分析中都有应用,但目前 尚没有应用于酱油产品。a MS、 O和电子鼻分离 分析技术在酱油挥发性风味物质的分离鉴别中都有应 用。从长远发展来看,现场取样要求设备小型化,因此有 必要开发便携式GC/MS仪器。 参考文献: [-1]Fabio Augusto。Alexandre Leite e Lopes,Cla udia Alcaraz Zini.Sampling and sample preparation for analysis of aro— mas and fragrances[J].Trends in Analytical Chemistry, 2003,22(3)l 160-169. 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