植物抗病基因工程研究进展

植物抗病基因工程研究进展

摘要随着植物抗病基因的分离,植物抗病机制的分子生物学和植物抗病基因工程取得了重大研究进展。该文就植物抗病基因工程的原理、目的基因、转化方法等进行综述,并对植物抗病基因工程的应用前景做了展望。

关键词植物;抗病基因;基因工程;原理;目的基因;转化方法;前景

Advancesinthe ResearchofPlant DiseaseResistanceGeneticEngineering

HE Ming

(Research and Development Center for Fine Chemicals of Guizhou University,Guiyang Guizhou 550025)

AbstractWith the isolation of plant disease resistance genes in recent years,it made significant progress that molecular biology of plant disease resistance mechanisms and genetic engineering of plant disease resistance.The principle,targeting genes,transformation methods and view of application prospect of plant disease resistance genetic engineering were summarized.

Key words plant;disease resistance genes;genetic engineering;principle;targeting genes;transformaion methed;view of application prospect

随着世界人口的迅速增长,粮食问题已成为人类生存的关键问题。有专家预测,到2050年,全球人口总数将膨胀至90亿[1]。剧增的人口将给为人类提供粮食的农业生产带来严峻的挑战。众多学者为提高作物产量作了许多努力,也取得了很大成果。但是,长期以来,因病菌侵染而造成的作物产量损失也是巨大的。当前,防治病害的主要策略是改进栽培措施和施用化学杀菌剂。但这只能从一定程度上控制病害的流行而不能从根本上解决问题,而且化学药剂所带来的环境污染和病原抗药性生理小种的形成等问题也给病害防治造成了更大的障碍。

自上世纪90年代以来,分子生物学理论和技术的不断发展完善,使人们能够从分子水平上研究植物与病原菌的相互作用机制,植物基因工程的兴起更是为病害的控制提供了更广泛的选择余地。基因工程被认为是一项能为人类提供以食用动物为基础的健康和充足粮食途径的关键技术,在应用中扮演着重要角色。在植物抗病基因工程的研究历程中,以植物抗病毒基因工程开展最早[2],发展也最为迅速,部分转基因植株已开始用于生产。随着植物抗病反应机制和病原菌致病机理研究的深入,近年来植物抗病基因工程的研究取得了很大的进展。

1植物抗病基因工程的原理

人们对植病互作机制的认识,主要来源于对模式植物拟南芥的研究。并且已经从拟南芥中鉴定和克隆了许多抗病基因,给其他作物的抗病性遗传分析提供了理论基础[3-4]。

病原菌对宿主植物成功的感染,包括接触识别、崩解植物理化防御系统、产生毒素、灭活整个植株或部分组织的代谢生理活性。病原菌往往含有致病基因和毒性基因,其表达调控包含有复杂的信号传导。

在经典遗传学中,植物与病原物的互作被看作是由基因型控制的,植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因R与相应的来源于病原物的无毒基因avr互相作用所决定的,即“基因对基因”学说。Flor[5]通过亚麻与亚麻锈病菌之间的相互关系的研究,发现真菌的显性avr基因的产物(后来被描述成小种专化性诱导因子)能被R基因的产物识别,从而激发植物抗性。

植物抗病基因工程指的是用基因工程(遗传转化)的手段提高植物的抗病能力,以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括:抗病及其他相关基因的分离和克隆;与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒;用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒;筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外,还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物,从后代中筛选具有抗病能力的个体,经过稳定转化得到转基因抗病植株。

2用于植物抗病基因工程的目的基因

2.1植物抗病基因

植物抗病基因工程选用的最佳目的基因来自植物自身的抗病基因,即上述的R基因。近20年来,世界上许多重要实验室一直致力于植物R基因的克隆,直到1992 年才取得突破,成功地克隆出第1个玉米抗圆斑病基因Hm1[6]。迄今人们已经从十余种不同植物中成功地克隆出了20多种R基因,如番茄抗叶霉病基因Cf2-9[7]、Cf-2[8]、Cf-4[9],水稻抗白叶枯病基因Xa21[10],拟南芥的抗丁香假单胞杆菌基因RPS2[11]、RPM1[12]、抗霜霉病基因RPP5[13],亚麻抗锈病基因L6[14],大麦抗白粉病基因Mol[15]等。这些抗病基因多数已转化到相应的感病植株中,并均使转基因植株表现出了对病原菌特定生理小种的抗性。

随着基因工程学研究的深入和发展,将获得大量的植物高密度遗传图谱,这为定位克隆技术的广泛应用提供了有利的条件和丰富的信息。同时由于R 基因在序列和结构上的相似性,利用与已知R 基因的同源关系分离新的R 基因,将大大提高克隆效率与速度。

2.2病原体无毒基因

针对转基因植物抗性单一的问题,De Wit[16]于1992年根据基因对基因学说提出了“双组分系统”理论。即在某一特定的植物病原菌互作系统中,把病原菌的无毒基因与一个特殊的启动子融合在一起组成“双组分系统”,导入含相应抗病基因的植物中,当外源病原菌侵染或其产生的非专化性激发子作用时,该启动子就能及时快速且局部地做出反应,并启动avr 基因的表达,2者的产物引起植物的过敏反应,从而使植物抗病。据此方法获得的转基因植物具广谱抗性,对真菌、细菌、病毒及线虫等病原物的侵染都有抗性。

已克隆的avr基因有50多个,多源于细菌,而真菌avr基因的克隆难度较大。超过40种细菌的无毒基因被克隆、测序,这些无毒基因主要来源于假单胞属Pseudomonas和黄单胞属Xanthomomas。目前无毒基因在植物抗病基因工程上的实际应用远比植物本身的抗病基因广,且有良好的应用前景,因此对病毒基因的克隆具有重要的意义。

2.3植物防卫反应基因

植物防卫反应基因是由抗病基因产物与无毒基因产物相互识别后激活的,对病原菌有直接作用的植物基因在植物的防御机制中起着重要作用。因此,导入植物防卫基因是目前抗病基因工程中较为有效的一种策略[17]。已分离的防卫基因有:参与植保素(PA)合成的相关酶基因、病程相关蛋白(PR)基因、木质素合成相关基因、钝化病原菌致病酶或毒素的蛋白质基因、富含羟脯氨酸糖蛋白和富含甘氨酸糖蛋白的基因、核糖体失活蛋白基因、溶菌酶基因等。

2.3.1病程相关蛋白(PR)基因。病程相关蛋白(PR)基因是目前的研究热点,该基因对植物的抗病性,尤其是系统获得性抗性具有重要作用。近年来陆续发现的PR蛋白有:几丁质酶CHI、β-l,3葡聚糖酶GLU、类甜蛋白等。其中,又以CHI和GLU的研究最多。几丁质酶CHI和β-l,3葡聚糖是大多数植物病原真菌细胞壁的主要成分,CHI和GLU具有降解病原真菌细胞壁的作用,纯化的几丁质酶和葡聚糖酶单独或同时存在都能抑制病原真菌的生长,从而抑制病原真菌的侵染。现已从菜豆、水稻、烟草、拟南芥、油菜和甜菜等中克隆到几丁质酶基因,从大豆、烟草、大麦和豌豆等作物中克隆到葡聚糖酶基因。由菜豆几丁质酶基因单独转化、烟草葡聚糖酶基因与菜豆几丁质酶基因联合转化得到的转基因植株分别对烟草立枯丝核菌和烟草赤星病有较高抗性[18]。一些葡聚糖酶基因也从大豆、大麦、烟草等作物中分离,与合适的启动子构建重组质粒后转化植物获得了转基因植物。Zhu等[19]报道水稻碱性几丁质酶基因和苜蓿葡聚糖酶基因的转基因烟草对烟草蛙眼病表现出了较只转一种基因的烟草更强的抗性。

2.3.2溶菌酶基因。溶菌酶具有几丁质酶和葡聚糖酶的双重活性,对植物病原菌表现出很强的裂解活性。在已获得的T4噬菌体溶菌酶基因的转基因马铃薯中,虽然只有低水平的合成表达,但能有效地分泌到由胞间隙中,明显提高了对马铃薯黑胫病的抗性。

2.4其他生物的抗菌蛋白基因

自然界中的各种生物对病原菌都有其自身的防御机制和相应的抗菌物质,这为人们寻找抗菌蛋白基因提供了一个广阔空间。目前,人们已从昆虫、动物、细菌、真菌中分离到许多抗菌蛋白,将其笼统称为“抗菌肽”。

抗菌肽主要是通过形成离子通道直接破坏细胞膜来杀灭病原菌,因此病菌很难对基产生抗性。加之抗菌肽具有抗菌谱广、分子量小、基因操作容易等特点,因此分离和克隆这些抗菌肽基因并将其转入植物中是当前抗真菌基因工程的一个主要研究内容,植物转抗菌肽基因工程的研究已成为植物抗病育种的重要途径。Yevtushenko等[20]曾将Cecropin基因导人烟草中,发现可降低烟草真菌病害引起的死亡率。

3转化方法

自1983年第一例转基因植物-烟草在美国获得成功以来[20],经过科学家20多年的探索,转基因技术日臻成熟,已形成了以农杆菌转化和基因枪转化技术为主体的两大植物转化系统。其中,农杆菌介导的基因转移占绝大多数,成功率最高。基因枪法也是主要的转化方法,其他的转化方法也都成功地得到了转基因植株,各具特点。

3.1农杆菌介导法

第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。农杆菌介导的基因转化方法是迄今最可靠、最有效的转化方法。

根癌农杆菌含有Ti 质粒,Ti 质粒上的T-DNA 可以插入到植物基因组中,诱导宿主植物中瘤状物的形成。因此,将外源目的基因插入到T-DNA 中,借助Ti 质粒的载体作用,使目的基因在宿主植物中整合、表达。

农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,然后利用组织培养的方法培育出转基因植株,并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。农杆菌介导法又可根据其受体材料不同分为原生质体共培养法、叶盘法和创伤植物感染法,其中叶盘法在许多植物上得到广泛应用。

3.2基因枪法

该法又称粒子轰击,高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术,是由美国康奈尔大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功,其基本原理是利用亚精胺、聚乙二醇的粘附作用将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面,然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织;并在1987年,Klein[21]首先报道了应用此技术将烟草花叶病毒RNA吸附到钨粒表面,轰击洋葱表皮细胞,经检测发现病毒RNA能进行复制,并以同样技术将氯霉素乙酰转移酶基因导入洋葱表皮细胞。

基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织,突破了基因转移的物种界限,也不必制备原生质体,实验步骤比较简单易行,具有相当广泛的应用范围。现在,该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上试用成功。

3.3其他方法

花粉管通道法最早由周光宇等[22]提出,其基本原则是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道使外源DNA 沿着花粉管进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞的方法。化学诱导法的主要原理就是聚乙二醇、多聚-L-鸟氨酸、磷酸钙在pH值较高的条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子[23]。电穿孔法又称电激法,首先(下转第58页)

(上接第54页)

由Neumann[24]提出,即在高压电脉冲作用下,在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道,从而发生外源DNA的摄取。此外,还有脂质体转化法、低能离子束法、病毒载体转化法、转座子介导法和浸泡法等。

4植物抗病基因工程的前景展望

植物基因工程是细胞水平和分子水平上的遗传操作,其最大优点是能地利用人们所感兴趣的外源基因使工作更具目的性,给植物抗病育种提供了一条有用的途径。

但是抗病基因所介导的抗病性具有高度专化性,只针对一种病害的一个或几个小种,抗病谱范围比较窄;而导入防卫反应基因的转基因植株大多表现出部分抗性。因此,多数转单基因的抗病植物,抗病机制单一,抗多病害或抗多小种的能力低,一旦病原菌群体发生变化,抗病性就可能被克服。因此植物抗病基因工程的趋势是创建持久、广谱的抗病性。

综上所述,植物抗病基因工程要获得深入发展,加强相应的基础研究是十分重要的。病原菌致病手段多种多样,植物的防卫机制也是多方面的,随着植物抗病机制的深入研究,抗菌基因工程的策略和手段也会得到不断拓宽,必将在植物病害防治中发挥更大的作用。

5参考文献

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