单分子水平的酶催化与基因表达研究

物理化学学报（Ｗｕｌｉ　Ｈｕａｘｕｅ　Ｘｕｅｂａｏ）　１９７６　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ．一Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．，２０１０，２６（７）：１９７６－１９８７　Ｊｕｌｙ　【Ｒｅｖｉｅｗ］　ｗｗｗ．ｗｈｘｂ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　单分子水平的酶催化与基因表达研究　苏晓东１Ｉ２，　金坚石　，ｓ　谢晓亮　（　北京大学生物动态光学成像中一Ｃ￣，（ＢＩＯＰＩＣ），北京１００８７１；　北京大学生命科学学院，北京１００８７１　。北京大学前沿交叉学科研究院，北京１００８７１；４Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ　０２１３８，ＵＳＡ）　摘要：　近半个多世纪以来生命科学取得了非凡的进展，从ＤＮＡ双螺旋结构的提出，到第一个酶晶体结构的被　解析，都得益于像ｘ射线衍射、核磁共振、质谱这样的物理化学１』ｌ的发展．如今，在深入细致地定量研究生物　活体系统中我们正面临新的挑战，例如：了解酶及其他大分子复合物在体内是如何实时工作的，它们在分子数很　少时是怎样工作的，在活细胞中大分子复合物是如何协调工作的，以及不同的基因在活细胞中分子数很少的情　况下是如何实现表达和不表达的等等．近十多年来，单分子成像，超高分辨率显微镜和单分子操纵技术在世界范　围内被广泛地运用于生物医学研究，对生物化学和分子生物学的发展产生着深远的影响，因为运用这些单分子、　超高分辨技术，使很多如上述的令人感兴趣的生物学问题实现了单分子层面上的研究和理解．本文拟就近年来　相关的物理化学方法特别是单分子方法和技术在生物医学中的应用做一个简要介绍．　关键词：　单分子酶学；米氏方程；荧光蛋白；乳糖操纵子；基因表达；阻遏子　中图分类号：０６４３　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ａｔ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｌｅｖｅｌ　ＳＵ　Ｘｉａｏ—Ｄｏｎｇ　，。　ＪＩＮ　Ｊｉａｎ—Ｓｈｉ　。ＸＩＥ　Ｓｕｎｎｅｙ　Ｘｉａｏｌｉａｎｇ　Ａ　（　Ｂｉｏｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＩＯＰ１Ｃ），Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８７１；２Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＬｉｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，ＢｅＵｉｎｇ　１００８７１；３ＡｃａｄｅｍｙｆｏｒＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ　Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８７１　４ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｙａｎｄＣｈｅｍｉｒｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｙｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ　０２１３８，ＵＳＡ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｌａｓｔ　ｈａｌｆ　ｃｅｎｔｕｒｙ，ｔｈｅ　ｏｖｅｒｗｈｅｌｍｉｎｇ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｇｒｅａｔｌｙ　ａｉｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，ｓｕｃｈ　ａｓ　Ｘ—ｒａｙ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｅｔｃ．Ｉｎ　ｒｅｃｅｎｔ　ｙｅａｒｓ，ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｈａｖｅ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｈｅ　ｗａｙ　ｍａｎｙ　ｂｉｏｌｔｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｒｅ　ａａｄｄｒｅｓｓｅｄ．Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　ｆｒｏｍ　ｈｅｓｅ　ｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ　ｔｏ　ｅｍｅｒｇｅ．Ｗｅ　ａｒｅ　ｎｏｗ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｆｏｌｌｏｗ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｉｎ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ，ａｎｄ　ｍｏｎｉｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｏｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂａｓｉｓ．　Ｔｈｅｓｅ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ　ｗｉｌｌ　ｌｉｋｅｌｙ　ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｅ　ｏｔｌｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　ｍａｎｙ　ｙｅａｒｓ　ｔｏ　ｃｏｍｅ．Ｉｎ　ｈｉｔｓ　ｒｅｖｉｅｗ，ｗｅ　ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ　ｔｈｅ　ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｓｔ　ｄｅｃａｄｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｅｌｄｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，ｅｍｐｈａｓｉｚｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｏｒｋ　ｏｆ　Ｓｕｎｎｅｙ　Ｘｉｅ　ｓ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：　Ｓｉｎｇｌｅ—ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ—Ｍｅｎｔｅｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｌａｃ　ｏｐｅｒｏｎ；　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　最近半个多世纪以来，生命科学正在以前所未　有的步伐发展，生物医学提出的种种问题吸引着数、　理、化、计算机、工程技术各个领域的优秀人才，而很　多重要问题的解决是需要多个学科的共同努力方有　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｍａｖ　１４．２０１０；Ｒｅｖｉｓｅｄ：Ｊｕｎｅ　１１，２０１０；Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎ　Ｗｅｂ：Ｊｕｎｅ　１８，２０１０．　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒｓ．Ｓｕ　Ｘｉａｏ－Ｄｏｎｇ．Ｅｍａｉｌ：ｘｄｓｕ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；Ｔｅｌ：＋８６—１０—６２７５９７４３．Ｘ１Ｅ　Ｓｕｎｎｅｙ　Ｘ．，Ｅｍａｉｌ：ｘｉｅ＠ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ．　Ｔｈｅ　ｐｒｏｊｅｃｔ　ｗａｓ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　９８５　Ｐｒｏｇｒａｍ　ａｔ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｎａ．　北京大学９８５项目资助　本文根据谢晓亮教授２００８年６月５日在Ｎｏｂｅｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１３８　ｏｎ“Ｓｉｎｇｌｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｊｕｎｅ　１－６　２００８　ｉｎ　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ的报告整理编译．　⑥Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ　ｏｆｉｆｃｅ　ｏｆＡｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｃｏ—Ｃｈｉｍｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ　Ｎｏ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　１９７７　望完成，生物医学已经成为带动科学发展的“领头学　科”，我们目前正在见证着“二十一世纪是生物医学　的世纪”．　果相同，这是生物体外进行稳态酶动力学研究的基　础．然而，在实际的生物细胞内部，特别是很小的细　菌细胞中（通常为２００—３００　ｎｍ宽，而一些大分子复　“工欲善其事，必先利其器”．回溯现代生命科学　的发展，每一个重要的飞跃后面都是新方法和新技　术的进步．这些技术来自于其他领域的知识积累和　经验总结．新的技术和新的实验方法所带来的不仅　合物如核糖体已有２０—３０　ｎｍ大小，染色质会更大），　分子数很少（极端情况的染色质ＤＮＡ分子只有一　个），可以设想很多生化反应是在分子数很少的非均　相体系中进行的，单个分子轨迹平均就完全可能不　仅是实验效率的提高，同时还使得许多新的现象得　以展现，从而引发并解决新的生命科学问题．在诺贝　尔物理学奖和化学奖中，由于对仪器或测试方法进　行创新而获奖的科学家约占四分之一．而在生命科　学和医学领域，技术与仪器的进步带来的不仅仅是　我们对生命认识的加深，而且在极大程度上改善了　人民的健康和生活质量．现有的仪器和技术手段在　生命科学与医学的研究中往往存在静态、低效、非活　体等缺点，难以满足生物体这一特定体系研究的需　求．要实现原位、实时，动态多参数检测，就必须在方　法、技术、设备等各个方面有所突破，提出新的想法，　发展新的研究平台．现代生命科学研究和医学诊断　与治疗技术对相关仪器和技术的开发提出了更高的　要求，其中最重要的一点就是如何在不同层次的活　体上获取动态的生命活动信息．单分子技术及分子　成像技术作为我们认识生命过程、改善医学诊断的　一个重要手段，得到了生命科学、医学、工程学、化　学、材料学等多个学科领域科研工作者的重视．正如　文献…所指出的那样，活细胞是２ｌ世纪的试管（Ｌｉｖ．　ｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｔｕｂｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　２１ｓｔ　ｃｅｎｔｕｒｙ）．这方面　的研究才刚刚起步，许多技术及应用需要综合生物、　物理、化学、工程等多学科知识，仅依靠单一学科难　以取得突破，急需多学科的交叉、协作与融合．我们　可以非常乐观地期待单分子生物物理技术及相关新　型显微镜及超高分辨率成像技术的发展和应用将会　在不远的将来给生物医学领域带来全新的视角及突　破性进展．　本文就一些近年来国际上发展出的物理化学方　法特别是单分子方法和技术在生物医学中的应用做　一个简要介绍．　１单分子技术在生物学中的应用　将统计力学的各态历经假设，应用于生化系统　（例如酶活性测量），可以认为在一个包含完全相同　个体的系综（纯化的蛋白溶液）中，当分子数足够大、　测量时间足够长的时候，系综测量和单分子测量结　等于系综平均结果，系统中单个分子的构象驰豫及　统计涨落行为对于整个系统的发展具有决定性作　用．系综测量的平均效应掩盖了许多对于理解单分　子个体行为非常重要的特殊信息．因此，我们需要进　行单分子动态检测以得到与时间相关的单个分子的　行为及时间与空间的分布状况，从而得以理解生物　大分子及生命体系更为全面的信息．　在上世纪九十年代初，首先在低温条件下口卅实　现了单分子探测后　，国际上许多实验室很快加入　到了发展室温下的单分子成像的挑战中来．室温下　单分子观测工作最初是用近场显微镜［１Ｏ－／２皖成的，　之后用远场荧光显微镜【ｌ３　使得实验方法变得更加　容易了．早在１９７６年Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ就已经认识到　５］，　实现室温下单分子探测的核心思想是运用显微镜降　低其激发体积来抑制背景信号的干扰［１６－１７　．现在看　来，室温探测，单分子成像和单分子远场显微镜技　术，以及后来兴起的单分子操纵技术等众多领域的　发展［１８－２ｏ］，包括更早期发展出来的单离子通道记录　（利用膜片钳：Ｐａｔｃｈ　Ｃｌａｍｐ）技术【２１】’打开了研究生物　学中丰富的单分子行为的大门，这些领域的快速发　展及其近年来取得的成果是非常令人振奋的．　随着各种单分子方法的发展和改善，对于工程　师和科学家们的挑战是在物理、化学和生物学的交　叉融合中发展出一个能提供新技术工具的科学领　域．当前，单分子成像，显微镜和单分子操纵在全世　界范围内被广泛地运用于生物医学研究，对生物化　学和分子生物学产生着深远的影响．主要原因是运　用这些技术，使很多令人感兴趣的生物学问题实现　了单分子层面上的研究和理解．　谢晓亮小组在生物化学领域做的第一个工作是　运用荧光探测技术观察单个酶分子的实时生物化学　反应和构象动力学　．由于体外实验的进展，单分子　酶学提供了对很多特殊系统的机理理解，以及对酶　催化机理的本质探讨，特别是后来发展的运用单分　子酶学方法来进行人类基因组大规模、高效率测序　的前景１ｚ３－３１］．　１９７８　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ．一Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．，２０１０　ＶＯ１．２６　单分子研究在生物学中是非常有用的，有一个　事实很好地说明了这一点．在活细胞的基本生物过　程中，像基因表达和调控发生时，染色体ＤＮＡ上的　个特定的基因可能只有一个或两个拷贝．结果是，　一２单分子酶学：涨落的酶催化　在所有生物学过程中，酶的本质都是起生物催　化功能，就是通过高效率和高特异性来加速生物化　学反应，这是一般人造系统所无法比拟的．尽管越来　越多酶的三维结构和相互作用网络被了解，但是探　索和理解酶在单分子水平上的实时工作是如何进行　的依然是一个生物学中至关重要的基本问题．　在１９９８年，谢晓亮实验室报道了单个胆固醇氧　化酶分子构象变化的实时观察结果，即黄素　酶（ｌｆａｖｏｅｎｚｙｍｅ）催化氧气氧化胆固醇的过程（见图　１Ａ）ｔ　．在这个酶的活性位点，黄素腺嘌呤二核苷酸　（ＦＡＤ）（见图１Ｂ）的氧化态是可以发出荧光的，而还　原态则不能．在过量的胆固醇和氧气存在时，来自固　定在琼脂胶上的单个酶分子的发射光展示了一个开　Ｂ　这些过程的出现变得具有随机性，且在不同细胞之　间是不同步的．因此，了解这些过程需要在单分子的　灵敏度下实时观察．在２００６年，谢晓亮小组发展了　在活细胞中单分子水平下研究这些过程的方法［３２－３３］．　之后，从那些研究中出人预料地看到了这些过程的　定量信息．　本文中我们比较系统地总结了在单分子酶学和　利用单分子观测技术研究活细菌中基因表达和调控　方面的工作，并且对生物医学中应用单分子研究的　未来前景作一个展望．　ＨＯ　Ｅ　ＦＡＤ　Ｅ—ＦＡＤＨ　一／　Ｈ２Ｏ２《———一Ｃ　０２　４Ｏ　３０　ｕ　兰　；２０　１０　Ｏ　５００　１０００　１　５００　Ｏｎ－ｔｉｍｅ（ｍｓ）　图１（Ａ）胆固醇氧化酶的催化循环，催化氧气氧化胆固醇的过程；这个酶的天然荧光活性位点ＦＤＡ首先被胆固醇底物分子　还原成无荧光活性的ＦＤＡＨ　，之后又被氧气氧化．（Ｂ）ＦＡＤ的结构，胆固醇氧化酶的活。Ｉ生位点．（Ｃ）单个胆固醇分子的部分　随时间变化的荧光强度曲线；每个激发光谱的开关循环与酶的构象转变相符合．（Ｄ）图（Ｃ）中的发射光谱持续时间的统计分　布，实线是两个常数分别为ｋ　【Ｓ】＝２．５　Ｓ　和ｋ２＝１５．３　Ｓ　的指数函数卷积，反映了中间态酶一底物复合物（Ｅｓ）的存在圈　Ｆｉｇ．１　Ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｔｉｍｅ　ｔｒａｃｅ　ｏｆ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｅａｃｈ　ｏｎ－ｏｆｆ　ｃｙｃｌｅ　ｏｆ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ　ｔｏ　ａｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｔｕｒｎｏｖｅｒ；ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ－ｔｉｍｅ　ｒｅｆｌｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ，ＥＳ，ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ．ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｔｚｚ］　ＮＯ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　１９７９　关行为（图１Ｃ）．等待时间直方图的指数增加和衰减　表明了酶一底物复合物的存在（图ｌＤ）．　通过对数据的统计分析处理，这一实验发现一　很自然地可以把速率常数的波动归因于酶分子　的构象互变，这一结果已经由Ｆｒａｕｅｎｆｅｌｄｅｒ和他的　合作者㈣早些时候在血红素蛋白光分解的工作中推　测出来．为了深入了解这一现象，谢晓亮课题组瞄　］　发展了一种可以直接观察到单个蛋白质的构象改变　的方法（例如：图２（Ａ，Ｂ）．这是通过一种距离依赖型　个酶分子的催化速率表现出起伏现象　在常规实验背后的现象原来是普遍的．　个酶分　子没有催化速率常数！更加让人惊讶的是，这一隐藏　Ｂ　一　Ｂ】０ｕｃ　｝：０ｕ０　Ｄｅｌａｙ　ｔｉｍｅ　ｆｎｓ　Ｏ　１　量　Ｏ　Ｏ　０　Ｏ　１　５Ｏ　ｔ／ｓ　Ｄ　２００　０　００　０　０５　０　１０　，　）　Ｉ／Ｓ　图２（Ａ）荧光素（ＦＬ）和荧光素抗体（ａｎｔｉ．ＦＬ）复合物，构成电子转移的给体和受体，分别为Ｔｙｒ３７和ＦＬ；（Ｂ）单个ＦＬ　分子的单指数荧光寿命衰减曲线（黑线），ＦＬ／ａｎｔｉ．ＦＬ复合物的多指数荧光寿命衰减曲线，整体层面（绿线）和单分子层面　（红线），以及仪器的响应曲线（蓝线）；（Ｃ）给体和受体之间距离的部分数据，概率密度函数Ｐ（　）关于ｘ（ｔ）的分布满足　高斯分布；（Ｄ）平均受力的谐振势（Ｈａｒｍｏｎｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａ１），　）＝一‰Ｔ　Ｉｎ［Ｐ（　】；（Ｅ）图（Ｄ）中给体・受体距离的自相干　函数给出了距离起伏出现在较宽的时间尺度上阁　Ｆｉｇ．２　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＬ）ａｎｄ　ａｎｔｉ－ＦＬ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｄｏｎｏｒ　ａｎｄ　ａｃｃｅｐｔｏｒ，Ｔｙｒ３７　ａｎｄ　ＦＬ，　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｏｎｏ　ｏｒ　ｍｕｌｔｉ－ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｅｃａｙ　ｆｏｒ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ＦＬ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ｂｌａｃｋ　ｃｕｒｖｅ），　ｔｈｅ　ＦＬ／ａｎｔｉ・ＦＬ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｔ　ｂｏｔｈ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ（ｇｒｅｅｎ　ｃｕｒｖｅ）ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ｒｅｄ　ｃｕｒｖｅ）ｌｅｖｅｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ｂｌｕｅ　ｃｕｒｖｅ）．Ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｏｎｏｒ－ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ（Ｄ）　ｔｈａｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅ　ｂｒｏａｄ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｓｃａｌｅ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｔ￣］　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ．・Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．，２０１０　ＶＯ１．２６　探针的电子转移来实现的，这一技术不但补充了荧　度上出现较大的起伏依然很好地成立的原因．对于　光共振能量转移技术（ＦＲＥＴ）ｔ。　，而且可以在完整的　蛋白中探测０．１　ｎｍ尺度上的距离波动（图２Ａ）．在一　个含有大量同种酶分子的系统来说，这些单分子　水平上固有的起伏是不重要的：要刻画一种酶的特　一个电子转移给体和受体之间的距离可以在很长的时　间尺度上被找到，从ｌ０　ｓ一直到１０　ｓ（图２（ｃ—Ｅ））．　征，了解其系综的平均结果就足够了．尽管如此，如　果在一个活细胞中，一个特定的酶只有一个或者很　少个数，这些起伏就会产生很大的生理影响．　强调单分子酶变构实验明显不同于传统的体外　酶学实验是非常重要的，这些体外实验一般被设计　平衡构象变化是另一个普遍存在于自然界的现　象，已经在很多个研究体系中被发现，且在相同的时　间尺度上都被观察到了催化速率的起伏现象　”．　在如此之宽的时间尺度上的构象变化的原因是因为　酶作为一种生物高分子聚合物，具有柔韧但又有玻　璃态的性质㈤，因此对酶催化反应速率产生了很大　而又有趣的影响．　一般而言，单分子酶学的限制主要是检测手段　的发展．这里，我们列举了用到荧光检测技术的单分　子酶学构象变化的实验：（１）一个荧光活性位点，用　来描述胆固醇氧化酶；（２）荧光标记的底物分子，如　腺嘌呤核苷三磷酸（ＡＴＰ）或者脱氧ＡＴＰ（ｄＡＴＰ），这　些都需要低底物浓度　或者零模波导（ｚｅｒｏ—ｍｏｄｅ　ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）来抑制　；（３）荧光共振能量转移（ＦＲＥＴ）　可以通过一些酶的触发来报告构象变化，这样的酶　有葡萄球菌核酸酶Ｉ４５，］，核糖体　，Ｔ４溶菌酶［钢；（４）荧　光团的强度变化是与一个ＤＮＡ聚合酶引起的构象　变化相关的　；（５）荧光基质分子通过酶催化反应　产生荧光产物分子，这一过程是对辣根过氧化物酶　（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）提出的　．因为荧光团会不　断地充满激发体积和扩散出去，这个实验避开了妨　碍其他所有实验的光漂白问题，以及提供了一个足　够长的时间推移追踪尺度【　”．　大部分的整体酶催化动力学可以用经典的米氏　方程（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．Ｍｅｎｔｅｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ）来颇为完美地描　述　．对发生在多时间尺度上的构象动力学进行观　察会发现一个非常有趣的问题：为什么在单分子层　次上的动力学波动的分布如此大，却依然能很好地　满足米氏方程呢？　谢晓亮课题组还在ｐ．半乳糖苷酶（Ｂ—ｇａｌａｃｔｏｓｉ．　ｄａｓｅ）和荧光基质上设计了一个单分子实验，这个实　验提供了极好的统计图像（图３）￣５ｏＪ．这个研究允许我　们确认被分散的动力学（图３Ｃ）和在多时间尺度上　（１０　ｍｓ一１０　ｓ）催化速率的起伏（图３Ｄ）．有趣的是，尽　管存在起伏，除了　和　具有不同的微观解释外，　也就是不同的构象异构体的加权平均，米氏方程依　然可以用来解释单个酶的基本原理　．　这解释了为什么米氏方程在很宽范围的时间尺　成在非平衡定态下控制不变的底物浓度［弱删，而单　分子才是活细胞中常见的情况．　３细菌的基因表达与调控：单分子层次下的　生命现象　一个引人注目的挑战是在活细胞中实现单分子　实验．现在已经发展了两种策略来研究在单分子层　面上的ＤＮＡ和蛋白相互作用：实现固定探测ｎ４３２，５５－５７］　和频闪观测照明（ｓｔｒｏｂｏｓｃｏｐｉｃ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）ｔ”，这些技　术通过特殊标记来探测个别的荧光蛋白分子（ＦＰ），　可以达到微秒时间分辨率和纳米量级的空间精确　度［５８１．而在这些工作之前，荧光蛋白分子（ＦＰｓ）的串联　反复技术（ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ）￣经被用来监测在活细胞　中的单个ｍＲＮＡ分子　删．谢晓亮课题组已经运用　这两项技术完成了很多分子生物学基本过程的研　究，前者比后者具有更加优越的荧光蛋白灵敏度．　细菌中基因的表达是一个典型的单分子问题，　因为大部分基因经常在一个细胞中以一份或者两份　拷贝出现．２００８年，谢晓亮课题组报道了第一个直　接观察蛋白分子产生过程的实验，在单个活大肠杆　菌细胞中，一次只产生一个蛋白分子，看到了基因表　达的定量信息（图４）　删．在被抑制的状态下，蛋白　分子以突然爆发的方式产生（图４Ｂ），每个突发事　件（ｂｕｒｓｔ）源于单个信使ＲＮＡ（ｍｒ￣Ａ）分子的随机转　录；一个突发事件中蛋白的拷贝数满足理论上事先　预言的指数分布（图４Ｄ）Ｉ６”．　基因表达被转录因子（ＴＦｓ）调控，转录因子绑定　到染色体ＤＮＡ上的特定序列上，被称作操纵基因，　通过ＲＮＡ聚合酶来控制转录［５２－ｏ３１．谢晓亮课题组第　一个在活细胞中，通过定位的方法实现了一个转录　因子在染色体ＤＮＡ上的绑定和解离的实时观察实　验Ｉ５７Ｊ．乳糖阻遏子（Ｌａｃ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）被连接上一个黄色　荧光蛋白（ＹＦＰ），探测其对诱导物乳糖类似物的增加　和稀释的响应　．在高诱导物浓度时，在很短时间内　实现诱导物的绑定，乳糖阻遏子从乳糖操纵子上解　ＮＯ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　Ｂ　１９８１　Ａ　ＲＧＰ　Ｒ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）　ｃｏｎｆｏｃａＩ　ｂｅａｍ　Ｄ　Ｅ　５Ｏ　∽　兰　Ｅ　３０　３ｏ　０　台　Ｖ　１Ｏ　ｌＯ　２Ｏ　６０　ＩＯ０　２０　６Ｏ　【　／（ｒｅｔｏｏｌ　Ｌ）　【　。。／（ｍｍｏｌ～Ｌ）　图３（Ａ）一个Ｂ．半乳糖苷酶分子连接到了一个链霉亲和素（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）上，链霉亲和素通过柔韧的ＰＥＧ链包裹在　聚苯乙烯小珠子上．小珠子固定在表面装有生物素（Ｂｉｏｔｉｎ）－ＰＥＧ的盖玻片上．发光底物ＲＧＰ的水解被一个酶催化，它的　荧光产物７．羟基吩嗯嗪酮（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ，Ｒ）在扩散受限制的聚焦体积内被探测；（Ｂ）以时间为横坐标的等待时间曲线的片段，等　待时间分布的直方图；（Ｃ）不同底物浓度【ｓ】下等待时间的指数函数拟合；（Ｄ）图（Ｂ）中数据等待时间的标准化的自相关函数，　这表明构象转换率起伏出现在较宽的时间尺度上，横跨至少四个数量级１０　到１Ｏ　ｓ；（Ｅ）单分子的米氏方程双倒数　作图（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ．Ｂｕｒｋｅ　ｐｌｏｔ），平均等待时间Ｊ『　１／【Ｓ】；（Ｆ）统计平均值的米氏方程双倒数作图很好地满足（Ｅ），　表明虽然有起伏存在，但是米氏方程依然是单分子酶学的基础【５０】　Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｏｔｏｇｅｎｉｃ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ＲＧＰ　ｉｓ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ（Ｒ）ｉｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ　ｉｎ　ｈｅ　ｔｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｌｉｍｉｔｅｄ　ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｖｏｌｕｍｅ．Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｗａｉｔｉｎｇ　ｔｉｍｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｉｍｅ　ｔｒａｃｅ　ｉｎ（Ｂ）．Ｔｈｉｓ　ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ　ｔｈｅ　ｂｒｏａｄ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ｓｃａｌｅｓ　ｏｆ　ｔｕｒｎｏｖｅｒ　ｒａｔｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ．　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ａｔ　ｌｅａｓｔ　ｆｏｕｒ　ｄｅｃａｄｅｓ　ｆｒｏｍ　１０～ｔｏ　１０　Ｓ．Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ａｎｄ　ｅｎｓｅｍｂｌｅ　ａｖｅｒａｇｅｄ　Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ．Ｂｕｒｋｅ　ｐｌｏｔ　ａｇｒｅｅｓ　ｗｅｌｌ　ｗｉｔｈ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ　ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ・Ｍｅｎｔｅｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ　ｈｏｌｄｓ　ｏｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂａｓｉｓ　ｄｅｓｐｉｔｅ　ｔｈｅ　ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ［５￣１　离下来（图５Ａ）．若突然对细胞外的诱导物浓度稀释　５０倍，则乳糖阻遏子重新绑定到操纵基因上需要６０　Ｓ的时间（图５Ｂ）．这已经通过问接的实验被推测出　来了，就是乳糖阻遏子寻找操纵基因需要通过绑定　１９８２　Ａｃｔａ　ｐ　Ｓ．・Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．。２０１０　ＶＯ１．２６　Ａ　０　４　２　Ｏ　４　Ｂ　：　：　：　：　Ｉ　）　Ｉ　ｌ　Ｉ　５０　Ｉｌ　Ｉ　：●　１ＯＯ　ｌ５Ｏ　：　：　，：　／———＜＝＝　／＿———、———　：＝＝　。　●　。　Ｉ　）　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　５Ｏ　●　Ｉｌ　Ｉ　Ｉｌ１　１００　ｌ５０　／，＿　——　＼——　：　’－　：●ｌ　ｌ　ｌｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｌ　Ｉ　ｌ　ｌ　Ｉ　馐０　Ｃ　Ｄ　Ｉ　　Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆｂｕｒｓｔｓ　ｐｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　图４（Ａ）荧光成像（黄色）的时间推移（快速拍摄慢速放映）视频覆盖在同时的大肠杆菌细胞的ＤＩＣ图像（灰色）上，这些大肠　杆菌细胞正在阻遏子存在下表达一个用ＹＦＰ标记的膜蛋白．每个黄色光斑表示通过基因表达产生一个ＹＦＰ；（Ｂ）ＹＦＰ分子　表达的时间跟踪图谱（左）沿着三个不同的细胞谱系（１ｉｎｅａｇｅｓ）（右）．纵轴是在之前的３　ｍｉｎ内新出现的蛋白分子的数量．虚　线标记了细胞的分裂时间．蛋白的合成出现了随机的爆发（ｂｕｒｓｔｓ），每个爆发相应于一个拷贝的ｍＲＮＡ以及它翻译的数量　多变的ＹＦＰ分子；（Ｃ）一个细胞循环的爆发表达中个数的统计直方图，拟合结果为均值为每一个细胞循环出现１．２个　ｍＲＮＡ的泊松分布；（Ｄ）每个基因爆发表达中ＹＦＰ分子数量分布的统计直方图，满足均值为每一个爆发表达出现４个　蛋白分子的指数分布［３２１　Ｆｉｇ．４　Ｔｉｍｅ．１ａｐｓｅ　ｍｏｖｉｅ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｅｓ（ｙｅｌｌｏｗ）ｏｖｅｒｌａｉｄ　ｗｉｔｈ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ＤＩＣ　ｉｍａｇｅｓ（ｇｒａｙ）ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ＹＦＰ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉＯｎ．Ｅａｃｈ　ｙｅｌｌｏｗ　ｓｐｏｔ　ｉｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｏｎｅ　ＹＦＰ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｈｉｓｔ￣ｌｇｒａｍ　ｏｆ　ｔｌＩｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｕｒｓｔｓ　ｐｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　ｉｓ　ｆｉｔｔｅｄ　ａ　Ｐｏｉｓｓｏｎ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　１．２　ｍＲＮＡ　ｐｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ＹＦＰｓ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｕｒｓｔ　ｆｏｌｌｏｗｓ　ａｎ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕ廿ｏｎ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｐｅｒ　ｂｕｒｓｔ　ＮＯ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　Ｂ　１９８３　嚣　圈圈■　ｇ三＿。　圈■一　茎薹　０兰　吕　图５（Ａ）用ＹＦＰ标记乳糖阻遏子的大肠杆菌细胞加入诱导物ＩＰＴＧ（终浓度达到１　ｍｍｏｌ・Ｌ　）之前和４０　Ｓ后；（Ｂ）乳糖操纵　子结合阻遏子的比例与时间的函数关系，不同曲线表示加入不同的ＩＰＴＧ量（终浓度表示）后的变化；（Ｃ）ＹＦＰ标记乳糖阻遏　子的大肠杆菌细胞被迅速稀释ＩＰＴＧ的浓度从１００到２　ｍｍｏｌ・Ｌ　之前和１　ｍｉｎ后．（Ｄ）操纵基因区域绑定了阻遏子的比例　与时间的关系，在迅速稀释了诱导物浓度５Ｏ倍后．重新绑定时间满足时间常数为６０　Ｓ的指数函数『５　Ｆｉｇ．５　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ＹＦＰ．１ａｂｅｌｅｄ／ａｃ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　４０　Ｓ　ａｆｔｅｒ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ＩＰＴＧ（Ａ），ｏｐｐｏｓｉｔｅ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　１　ｍｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｒａｐｉｄ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＴＧ　ｆｒｏｍ　１００　ｔｏ　２　ｍｍｏｌ・Ｌ～．Ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ／ａｃ　ｏｐｅｒｏｎｓ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｂｏｕｎｄ　ｔｏ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ　ｉｓ　ｐｌｏｔｔｅｄ　ａｓ　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ａｆｔｅｒ　ａｄｄｉｎｇ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎ￣ａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＩＰＴＧ，ａｎｄ　ｔｈｅ　０ｐｅｒａｔｏｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｓ　ｂｏｕｎｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ａｓ　ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｍｅ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃＯｎｃｅｎｔｒａｔｉＯｎ　ｂｙ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　５０．Ｔｈｅ　ｒｅｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｉｍｅｓ　ａｒｅ　ｅｘｐＯｎｅｎｔｉａｌｌｖ　ｆｉｔｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ｔｉｍｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ　ｏｆ　６０　ｓ［　７１　到ＤＮＡ上的一维扩散和在细胞质中的三维扩散来　实现（图６Ａ）ｆ　．利用频闪观测照明的方法（图６（Ｂ，　Ｃ）），这一实验定量地证明了在乳糖阻遏子在大肠杆　控制表型开关的分子机制．　实验中用黄色荧光蛋白来标记乳糖通透酶．而　这里讨论的两种特殊表型是：第一，在一定的通透　酶数量阀值以上，细胞将会有发荧光的膜以及能实　菌基因组上寻找操纵基因的大约６０　Ｓ时间中，它花　费大约９０％的时问与ＤＮＡ链非特异性结合沿着　ＤＮＡ链扩散，但只有大约５　ｍｓ的停留时间（图６Ｄ）．　在这些实验之后运用大肠杆菌中的经典的乳糖　操纵子研究了乳糖新陈代谢的基因调控Ｉ　，它包括　ｌａｃＺ和ｌａｃＹ两个基因分别编码Ｉ３一半乳糖和乳糖通　透酶　（图７Ａ）．１３－半乳糖催化乳糖的水解，而乳糖通　透酶是乳糖进入细胞的膜通道．乳糖操纵子的表达　是受乳糖阻遏子的调控的．在胞外诱导物浓度高时，　如甲基．１３－ｄ一硫代半乳糖苷（ｍｅｔｈｙｌ—Ｂ—ｄ．ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ—　ｓｉｄｅ（ＴＭＧ）），乳糖阻遏子从操纵基因上解离后允许　转录；一个群体中的每个细胞的ｌａｃ基因可以完全　现乳糖代谢；第二，在这一阀值以下，细胞将不会发　荧光和无法实现乳糖代谢．这两种表型在一个细胞　的种群中是共存的，所以会出现一个双峰分布（图　７ｃ）．根据一个通透酶合成的大突发事件，这一阀值　被确定是３００左右．　乳糖阻遏子是一个四聚体，因此可以同时绑定　到两个操纵基因上而形成一个ＤＮＡ环，在高诱导　物浓度时从ＤＮＡ上解离下来（图８Ａ）　．在低诱导物　浓度下（图８Ｂ），阻遏子无法从ＤＮＡ链上脱离下来．　当然，阻遏子自发的，个别的解离现象也会出现（图　４Ｂ），产生个别的信使ＲＮＡ以及少量的蛋白．但是，　阻遏子的完全解离，产生大量的通透酶表达的现象　极少发生，这一过程是需要乳糖操纵子触发诱导的　（图８ｃ）．现在通过这一实验我们在分子水平上知道　了双稳态基因开关是如何工作的　．　这一研究还证明了四聚体的乳糖阻遏子从　ＤＮＡ链上完全解离下来这一随机的单分子行为被　表达．可是，在中等诱导物浓度下，只有一部分细胞　的Ｌａｃ基因有很高的表达，这样可以使全部的大肠　杆菌种群维持环境中的资源．因此，从遗传学的角度　讲，完全相同的细胞在同样的环境中可以表现出不　同的表型．单个细胞的表型由双稳态的遗传开关，乳　糖操纵子来决定．而这一实验便是探索了单个细胞　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ．一Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．，２０１０　ＶＯ１．２６　Ｂ　Ｃ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　Ｄ　１　ｍｓ　ｌａｓｅｒ。　ｆ●　门　门　・－－Ｔ－．ｅ．－　ＣＣＤ　…ｒ］厂…ｌ厂…　ＤＩＣ　１　０００．ｍｓ　１０．ｍｓ　ｉｍａｇｅ　ｅｘｐｏｓｕ　ｒｅ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　图６（Ａ）在寻找ＤＮＡ目标序列中，一个ＤＮＡ阻遏子首先通过非特异性结合到ＤＮＡ链上，然后通过一维扩散在ＤＮＡ上行　走一个短片段后再从ＤＮＡ上解离下来，在细胞质中通过三维扩散，再重新绑定到不同的ＤＮＡ片段上去；（Ｂ）利用频闪照明观　测到的一颗子弹穿过苹果的图像．参考自Ｈａｒｏｌｄ和Ｅｓｔｈｅｒ　Ｅｄｇｅｒｔｏｎ基金（ｔｉｌｅ　Ｈａｒｏｌｄ　ａｎｄ　Ｅｓｔｈｅｒ　Ｅｄｇｅｒｔｏｎ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）；（Ｃ）频闪观测照明（ｓｔｒｏｂｏｓｃｏｐｉｃ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）的时间图（Ｔｉｍｉｎｇ　ｄｉａｇｒａｍ）．每个激光脉冲与ＣＣＤ设计成同　步，持续时间为Ｔ；（Ｄ）两幅不同曝光时间的荧光图像和相应的ＩＰＴＧ诱导的大肠杆菌细胞的ＤＩＣ图像．在１　Ｓ时，个别的乳　糖阻遏子－维纳斯（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｖｅｎｕｓ）分子出现弥撒的荧光背景．在１０　ｍｓ时，就能很明显地看到一个近扩散限制的成像．这说　明阻遏子的停留时间大约为１０　ｍｓ［　Ｆｉｇ．６　Ｉｎ　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｆｏｒ　ａ　ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ａ　ＤＮＡ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｆｉｒｓｔ　ｎｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ＤＮＡ　ｎａｄ　ｕｎｄｅｒｇｏｅｓ　１Ｄ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ａｌｏｎｇ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｂｅｆｏｒｅ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ＤＮＡ，ｄｉｆｆｕｓｉｎｇ　ｉｎ　３Ｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｈｔｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ，　ｎａｄ　ｒｅｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔ．Ｔｗｏ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃＯｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ＤＩＣ　ｉｍａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＰＴＧ－ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓ．Ａｔ　１　Ｓ，ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｌａｃ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ－Ｖｅｎｕｓ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｐｐｅａｒ　ａｓ　ｄｉｆｆｕｓｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．Ａｔ　１０　ｍｓ，ｔｈｅｙ　ａｒｅ　ｃｌｅａｒｌｙ　ｖｉｓｉｂｌｅ　ａｓ　ｎｅａｒｌｙ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ—ｌｉｍｉｔｅｄ　ｓｐｏｔｓ．　Ｔｈｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｉｓ一１０　ｍｓ．　细胞的生命过程的改变唯一决定，也就是从一个表　合并不同染料标记的脱氧核苷三磷酸，然后持续复　型转变到另一个表型．这一发现明确了单分子行为　制一条单链ＤＮＡ模板．当前，两个商业单分子测序　在生物学中的重要性　．　装置已经被开发出来［２６，２９］．而其他的，包括谢晓亮小　组，主要在探索补充技术，单分子测序提供了长阅读　４展望　长度（１ｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｌｅｎｇｔｈｓ）和低成本花费的前景，这将　单分子酶学获得了在体外实验中关于生物大分　极大地促进个性化医学的发展．　子工作机制的很多新的信息．毫无疑问，我们还有很　在活细胞研究中，首先选择研究乳糖操纵子，是　多问题需要去了解；这一领域将在未来的几十年中　因为这是一个非常有特点的系统，可以用它来证实　一直充满活力．在此期间，单分子酶学会产生社会影　这些新实验研究方法的可行性和可靠性，很幸运，从　响的终极运用是新一代ＤＮＡ测序方法，即单分子　这一系统中已经得到了很多新的信息．而这些技术　ＤＮＡ聚合酶的实时探测，这一技术的实现可以通过　真正的意义是可以运用这些方法去研究很多未知　ＮＯ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　ｂｉｍｏｄａＩ　ｄｉｓｌ　ｒｉｂｕｌｉＯｎｓ　Ａ　Ｃ　－０，ｔ．ｔｍｏｌ　Ｌ　ＴＭＧ　０．５０‘　Ｏ　４０．　＿３Ｏ，ａｍｏｌ　Ｌ　ＴＭＧ　＿４０￣ｔｍｏｌ　Ｌ　ＴＭＧ　Ｉ　口５０ｐｍｏｌ　Ｌ　ＴＭＧ　宝０．３０　Ｌ口１００ｐｍｏｌ　Ｌ　ＴＭＧ　｛０．２０　０　１０　Ｏ　０Ｏ　Ｂ　Ｄ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｅｌｌｓ　宣ｌＩｑＢｑ２　７　６　５　４　３　２　１　Ｏ　。０　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　ＬａｃＹ－ＹＦＰ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｐｅｒ　ｃｅｌｌ　图７（Ａ）大肠杆菌中乳糖通透酶的基因表达．通透酶ＬａｃＩ的表达增加了细胞内诱导物ＴＭＧ的浓度，这是ＬａｃＩ　从启动子上解离下来的原因，导致了更多的通透酶的表达；（Ｂ）细胞表达一个Ｌａｃｙ．ＹＦＰ融合物显示了全有或全无的　荧光，在一个荧光相衬的覆盖图上（底部，成像大小３１　ｔｔｍ×３１　ｍ）．拥有足够通透酶分子的细胞是被完全诱导的，　而含有太少通透酶的细胞是没有被诱导的．通过高灵敏度的荧光成像揭示了在未诱导的细胞中的单个通透酶分子　（上，成像大小：８　ｍ　Ｘ　１３　ｍ）；（Ｃ）荧光双峰分布显示了在一个种群中同时存在未诱导和诱导状态的细胞，它们的　相对比例取决于诱导物ＴＭＧ的浓度；（Ｄ）ＬａｃＹ．ＹＦＰ分子在双峰种群中未诱导部分在不同的ＴＭＧ浓度下的分布，　这是单分子灵敏度下测量的结果，表明一个通透酶分子不够诱导乳糖操纵子闻　Ｆｉｇ．７　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｓｅ　ｐｅｒｍｅａｓｅ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａ　ＬａｃＹ－ＹＦＰ　ｆｕｓｉｏｎ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ａｌｌ－ｏｒ－ｎｏｎｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ａ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ｐｈａｓｅ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｏｖｅｒｌａｙ．Ｂｉｍｏｄａｌ　ｆｌｕ０ｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉ０ｎｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈａｔ　ａ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｅｘｉｓｔｓ　ｅｉｔｈｅｒ　ｉｎ　ａｎ　ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ　ｏｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｔａｔｅ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＴＭＧ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｍｏｄａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＴＭＧ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ｏｎｅ　ｐｅｒｍｅａｓｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｉｓ　ｎｏｔ　ｅｎｏｕｇｈ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ／ａｃ　ｏｐｅｒｏｎｌ￣　的，未被研究清楚的系统．为了实现这一点，我们构　建了一个大肠杆菌突变种文库，这个文库中的每个　有和正常细胞一样的基因，但是具有抗药表型．抗性　菌的生物学基础还不清楚．通过上面提到的大肠杆　基因都用黄色荧光蛋白标记了．结果发现有大量的　基因在每个细胞中只表达很少量的蛋白．这就更加　菌突变种文库，我们有了可以在单分子灵敏度下研　究这些抗性菌基因表达的机会，这些研究可以提供　开发抗结核病药物的线索．　除了细菌研究，我们应该尝试在要求很高的哺　乳（真核）动物细胞上设计相似的单分子实验．像乳　糖操纵子和抗性菌这样，为什么细胞或是相同的基　证明了单分子测量的必要性．这一数据库可以作为　以后研究系统生物学的基础，很好地服务于生物医　学领域新的探索和发现．　单分子研究能帮助医学研究吗？我们相信一定　可以．举个例子，在前面讨论的关于基因开关的单分　子问题就会与肺结核研究相关，肺结核是由细菌致　因会发展成为不同的表型的问题和干细胞也很有关　系，这再一次强调了单分子行为对生物学非常重要．　我们希望这些被提到的几个事例可以说明，单　分子研究技术已经逐渐成熟，并将成为生物学研究　的强有力的工具以及为生物医学的发展提供激动人　病的致命疾病，它每年要夺去全球两百万人的生命．　在细菌中有一个一般性的现象：有一小部分非正常　细胞，被称作抗性菌（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ），具有抗药性．他们具　１９８６　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ．一Ｃｈｉｍ．Ｓｉｎ．，２０１０　ＶＯ１．２６　Ａ　Ｈｉｇｈ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　－一．　上　＾，、一ｒ＾　一，　，、一、厂＾一、，　Ｂ　Ｌｏｗ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　啼　一　ｌ　Ｃ　臣　Ｔｉｍｅ（ｍ‘ｌｎ）　，、，、，　＾，、，＾，、，．　，　，　Ｓｒｅａｌｆ　ｂｕｒｓｔ　Ｌａｒｇｅ　ｂｕｒｓｔ　图８（Ａ）在高细胞外诱导物浓度时，阻遏子就会从操纵基因上解离下来，由Ｍｏｎｏｄ和Ｊａｃｏｂ提出　（Ｂ）在低细胞外诱导物　浓度时，通过四聚体ＬａｃＩ阻遏子从一个操纵基因上部分解离，然后又快速地重新绑定．因此，在一个简短的解离事件下仅仅　只有一个转录物产生．可是，这个四聚体阻遏子也可以完全从两个操纵基因上同时解离下来，然后被诱导物分来，所以无法再　重新绑定上去，结果出现了一个爆发的大量表达；（Ｃ）一个事件时间推移的序列捕获了一个表型开关事件．在５０　ｍｍｏｌ・Ｌ　ＴＭＧ存在时，一个这样的细胞表型转变，表达了很多ＬａｃＹ．ＹＦＰ分子（黄色荧光覆盖），而其他的姐妹细胞没有出现　Ｆ　．８　Ａｔ　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｎｄｕｃｅｒ，ｔｈｅ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｉｔｓ　ｏｐｅｒａｔｏｒｓ，ｂｕｔ　ａｔ　ｌｏｗ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｎｄｕｃｅｒ，ｐａｒｔｉａｌ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｏｎｅ　ｏｐｅｒａｔｏｒ　ｂｙ　ｈｅ　ｔｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ　ＬａｃＩ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｉｓ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ａ　ｆａｓｔ　ｒｅｂｉｎｄｉｎｇ．Ｈｅｒｅ　ｓｈｏｗｓ　ａ　ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｃａｐｔｕｒｅｓ　ａ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｅｖｅｎｔ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　５０　ｍｍｏｌ・Ｌ　ＴＭＧ，ｏｎｅ　ｓｕｃｈ　ｃｅｌｌ　ｓｗｉｔｃｈｅｓ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｍａｎｙ　ＬａｃＹ　ＹＦＰ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ｙｅｌｌｏｗ　ｌｕｏｒｅｓｆｃｅｎｃｅ　ｏｖｅｒｌａｙ）ｗｈｅｒｅａｓ　ｈｅ　ｔｏｔｈｅｒ　ｄａｕｇｈｔｅｒ　ｃｅｌｌ　ｄｏｅｓ　ｎｏｔｔ￣　心的机会．我们相信单分子科学和技术为生物学和　２　Ｍｏｅｒｎｅｒ，Ｗ．Ｅ．；Ｋａｄｏｒ，Ｌ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，１９８９，６２：２５３５　３　Ｏｒｒｉｔ　Ｍ．１　Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｊ　Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，１９９０，６５：２７１６　４　Ｂｅｔｚｉｇ，Ｅ．；Ｔｒａｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５７：１８９　５　Ｂａｒｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．；Ｎｉｇ，Ｋ．Ｃ．；Ｗｈｉｔｔｅｎ，Ｗ．Ｂ．；Ｒａｍｓｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ａｎａ１．　医学提供最好的帮助的时代已经到来．　致谢：　我们非常感谢对此文做出贡献的所有同事及学生们，　Ｃｈｅｍ．，１９９３，６５：２３６０　６　Ｃａｓｔｒｏ，Ａ．；Ｓｈｅｒａ，Ｂ　Ｌａｓｅｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｖｏ１．５　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｄｉｇｅｓｔ　Ｓｅｒｉｅｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ：Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，１９９４：２１０　特别是谢晓亮实验室的工作人员．我们要特别感谢对于此综　述具有直接贡献的谢晓亮实验室过去和目前的成员们：Ｂｏｂ　Ｄｕｎｎ，Ｐｅｔｅｒ　Ｌｕ，Ｈａｗ　Ｙａｎｇ，Ｈｏｎｇｙｅ　Ｓｕｎ，Ａｎｔｏｉｎｅ　ｖａｎ　Ｏｉｊｅｎ，　Ｇｕｏｂｉｎ　Ｌｕｏ，Ｂｒｉａｎ　Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｗｃｉ　Ｍｉｎ，Ｊｉ　Ｘｉａｏ，Ｊｉ　Ｙｕ，Ｌｏｎｇ　Ｃａｉ，　Ｎｉｒ　Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊｏｈａｎ　Ｅｌｆ，Ｇｅｎｅ—Ｗｅｉ　Ｌｉ，Ｐａｕｌ　Ｃｈｏｉ，Ｋｉｒｓｔｅｎ　７　Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｗ．Ｐ．；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｐ．Ｍ；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ　Ｃ．：Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ　Ａ．Ｐｈｙｓ．　Ｒｅｖ．Ｌｅｎ．，１９９４，７２：１３２　８　Ｔｒａｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．；ＭａｃＫｌｉｎ，Ｊ，Ｊ；Ｂｒｕｓ，Ｌ＿Ｅ．；Ｂｅｔｚｉｇ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ，　Ｆｆｉｅｄａ，Ｈｕｉｙｉ　Ｃｈｅｎ，Ｙｕｉｃｈｉ　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｐｅｔｅｒ　Ｓｉｍｓ，Ｗｉｌｌ　Ｇｒｅｅｎ—　ｌｅａｆ，Ｓａｎｇｊｉｎ　Ｋｉｍ，Ｒａｈｕｌ　Ｒｏｙ和Ｓｒｉｎｊａｎ　Ｂａｓｕ．还要感谢谢晓　１９９４，３６９：４０　９　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．；Ａｌｌｅｎ，Ｅ．Ｖ．；Ｈｏｌｔｏｍ，Ｇ．Ｒ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｃ．；Ｍｅｔｓ，Ｌ．Ｐｒｏｃ　亮组的合作者们：Ｌｕｙｉｎｇ　Ｘｕｎ，Ｇｒｅｇ　Ｓｃｈｅｎｔｅｒ，Ｓａｍ　Ｋｏｕ，Ｂｉｎｎｙ　Ｃｈｅｒａｙｉｌ，Ｈｏｎｇ　Ｑｉａｎ，Ｇｒｅｇ　Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｅｒｉｃ　Ｒｕｂｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ　Ｋａｒｐｌｕｓ，　Ａｔｔｉｌａ　Ｓｚａｂｏ和Ｂｉｍａｎ　Ｂａｇｃｈｉ．　ＳＰＩＥ．１９９４．２１３７：２６４　１０　Ｂｅｔｚｉｇ，Ｅ．；Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６２：１４２２　ｌｌ　Ｘｉｅ，Ｘ　Ｓ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６５：３６１　１２　Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｗ．Ｐ．；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｐ．Ｍ；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　１　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．；Ｙｕ，Ｊ．；Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２：２２８　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６５：３６４　ｌ３　ＭａｃＫ１ｉｎ，Ｊ．Ｊ．：Ｔｒａｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．；Ｂｒｕｓ，Ｌ．Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ＮＯ．７　苏晓东等：单分子水平的酶催化与基因表达研究　１９８７　１９９６，２７２：２５５　１４　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．；Ｔｒａｕｔｍａｎ，Ｊ．Ｋ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ，１９９８，４９：４４１　１５　Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ，Ｔ．Ａｐｐ１．Ｏｐｔ．，１９７６，１５：２９６５　１６　Ｓｈｅｒａ，Ｅ．Ｂ．：Ｓｅｉｔｚｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｋ．；Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｍ．；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｓｏｐｅｒ，　Ｓ．Ａ．Ｃｈｅｍ，Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９０，１７４：５５３　１７　Ｒｉｇｌｅｒ．Ｒ．：Ｗｉｄｅｎｇｒｅｎ，Ｊ．ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，１９９０，３：１８０　１８　Ａｓｈｋｉｎ，Ａ．；Ｄｚｉｅｄｚｉｃ，Ｊ．Ｍ；Ｓｊｏｒｋｈｏｌｍ，Ｊ．Ｅ；Ｃｈｕ，Ｓ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．，　１９８６，１１：２８８　１９　Ｂｌｏｃｋ，Ｓ．Ｍ．；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｓ．Ｂ．；Ｓｃｈｎａｐｐ，Ｂ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，　３４８：３４８　２０　Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｂ．；Ｃｕｉ，Ｙ．；Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ，Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，２７１：７９５　２１　Ｓａｃｋｍａｎ，Ｂ．；Ｎｅｈｅｒ，Ｅ．Ｓｉｎｇｌｅ—ｃｈａｎｎｅｌ　ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ．２ｎｄ　ｅｄ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｌｅｎｕｍ，１９９５　２２　Ｌｕ，Ｈ．Ｐ．；Ｘｕｎ，Ｌ．：Ｘｉｅ，Ｘ　Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１８７７　２３　Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ，Ｉ．；Ｈｅｂｅｒｔ，Ｂ．；Ｋａｒｔａｌｏｖ，Ｅ．；Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ　ｓ．Ａ　．２００３，１００：３９６０　２４　Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ，Ｗ．Ｊ．；Ｂｌｏｃｋ，Ｓ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１３：８０１　２５　Ｇｕｐｔａ，Ｐ　Ｋ．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．，２００８，２６：６０２　２６　Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．：Ｂｕｚｂｙ，Ｐ．Ｒ．；Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｈ．；Ｂｅｅｒ，Ｅ．；Ｂｏｗｅｒｓ，Ｊ．；　Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙ，Ｉ．：Ｃａｕｓｅｙ，Ｍ．；Ｃｏｌｏｎｅｌｌ，Ｊ．；Ｄｉｍｅｏ，Ｊ．；Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，Ｊ．　Ｗ．；Ｇｉｌａｄｉ，Ｅ．；Ｇｉｌｌ，Ｊ．；Ｈｅａｌｙ，Ｊ．；Ｊａｒｏｓｚ，Ｍ．；Ｌａｐｅｎ，Ｄ．；Ｍｏｕｌｔｏｎ，　Ｋ．；Ｑｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．；Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ，Ｋ．；Ｔｈａｙｅｒ，Ｅ．；Ｔｙｕｒｉｎａ，Ａ．；ｗａｒｄ，Ｒ．　：Ｗｅｉｓｓ，Ｈ．；Ｘｉｅ，Ｚ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２０：１０６　２７　Ｋａｈｖｅｊｉａｎ，Ａ．：Ｋｅｌｌｅｔｔ，Ｓ．Ａｍ．Ｌａｂ，２００８，４０：４８　２８　Ｃｌａｒｋｅ，Ｊ．；Ｗｕ，Ｈ＿Ｃ．；Ｊａｙａｓｉｎｇｈｅ，Ｌ；Ｐａｔｅｌ，Ａ．；Ｒｅｉｄ，Ｓ．；Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ　Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏ１．．２００９。４：２６５　２９　Ｅｉｄ，Ｊ．：Ｆｅｈｒ，Ａ．；Ｇｒａｙ，Ｊ．；Ｌｕｏｎｇ，Ｋ．；Ｌｙｌｅ，Ｊ．；Ｏｔｔｏ，Ｇ．；Ｐｅｌｕｓｏ，Ｐ．；　Ｒａｎｋ，Ｄ．；Ｂａｙｂａｙａｎ，Ｐ．；Ｂｅｔｔｍａｎ，Ｂ；Ｂｉｂｉｌｌｏ，Ａ．；Ｂ．ｊｏｒｎｓｏｎ，Ｋ．；　Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｂ．；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ，Ｆ．；Ｃｉｃｅｒｏ，Ｒ．；Ｃｌａｒｋ，Ｓ．；Ｄａｌａｌ，Ｒ．；　Ｄｅｗｉｎｔｅｒ，Ａ．：Ｄｉｘｏｎ，Ｊ．；Ｆｏｑｕｅｔ，Ｍ．；Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ａ．；Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ，Ｐ．；　Ｈｅｉｎｅｒ，Ｃ．；Ｈｅｓｔｅｒ，Ｋ．；Ｈｏｌｄｅｎ，Ｄ．；Ｋｅａｍｓ，Ｇ．；Ｋｏｎｇ，Ｘ．Ｘ．；Ｋｕｓｅ，　Ｒ．；Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｓ．；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｐ．；Ｍａ，Ｃ．Ｃ．；Ｍａｒｋｓ，Ｐ．；　Ｍａｘｈａｍ，Ｍ：Ｍｕｗｈｙ，Ｄ．；Ｐａｒｋ，Ｉ．；Ｐｈａｍ，Ｔ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｍ．；Ｒｏｙ，Ｊ．；　Ｓｅｂｒａ，Ｒ．；Ｓｈｅｎ，Ｇ．；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ，Ｊ．；Ｔｏｍａｎｅｙ，Ａ；Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｋ．；　Ｔｒｕｌｓｏｎ，Ｍ．：Ｖｉｅｃｅｌｉ，Ｊ．；Ｗｅｇｅｎｅｒ，Ｊ．；Ｗｕ，Ｄ．；Ｙａｎｇ，Ａ．；Ｚａｃｃａｒｉｎ，　Ｄ．；Ｚｈａｏ，Ｐ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｆ．；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊ．；Ｔｕｍｅｒ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３２３：　１３３　３０　Ｉｂａｃｈ，Ｊ．；Ｂｒａｋｍａｎｎ，Ｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄｆｆ．，２００９，４８：４６８３　３１　Ｔｒｅｆｆｅｒ，Ｒ．；Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｖ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．，２０１０，２１：４　３２　Ｙｕ，Ｊ．；Ｘｉａｏ，Ｊ．；Ｒｅｎ，Ｘ．Ｊ．；Ｌａｏ，Ｋ．Ｑ．；Ｘｉｅ，ｘ．ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，　３１１：１６００　３３　Ｃａｉ，Ｌ．；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｎ．；Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４０：３５８　３４　Ａｕｓｔｉｎ，Ｒ．Ｈ．：Ｂｅｅｓｏｎ，Ｋ．Ｗ．；Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．；Ｆｒａｕｅｎｆｅｌｄｅｒ，Ｈ．；　Ｇｕｎｓａｌｕｓ，Ｉ．Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５，１４：５３５５　３５　Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｌｕｏ，Ｇ．Ｂ．；Ｋａｍｃｈａｎａｐｈａｎｕｒａｃｈ，Ｐ．；Ｌｏｕｉｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｒｅｃｈ，　Ｉ．；Ｃｏｖａ，Ｓ．：Ｘｕｎ，Ｌ．Ｙ．；Ｘｈｅ，Ｘ．Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０２：２６２　３６　Ｍｉｎ，Ｗ．；Ｌｕｏ，Ｇ．Ｂ．；Ｃｈｅｒａｙｉｌ，Ｂ．Ｊ．；Ｋｏｕ，Ｓ．Ｃ．；Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．Ｐ＾ｙ　Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，２００５，９４：１９８３０２　３７　Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８３：１６７６　３８　Ｙｉｎｇ，Ｌ．Ｍ．　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．Ｊ．Ｐ　ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１９９８，１０２：１０３９９　３９　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．；Ｌｕ，Ｈ．Ｐ．　Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：１５９６７　４０　Ｋａｒｎｃｈａｎａｐｈａｎｕｒａｃｈ，Ｐ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｌｏｕｉｅ，Ｔ．Ｍ．；Ｘｕｎ，Ｌ．Ｙ．；Ｘｉｅ，　Ｘ．Ｓ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　，２００１，８０：６５５　４１　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．　Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，２００２，１１７：１１０２４　４２　Ｐａｒｅｎｔ，Ｋ，Ｎ．；Ｓｕｈａｎｏｖｓｌ（ｙ，Ｍ．Ｍ．；Ｔｅｓｃｈｋｅ，Ｃ．Ｍ．Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　２００７，６５：１３００　４３　Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．；Ｈａｒａｄａ，Ｙ．：Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｍ．；Ｓａｉｔｏ，Ｋ．；Ｙａｎａｇｉｄａ，Ｔ．　Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７４：５５５　４４　Ｌｅｖｅｎｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊ．；Ｔｕｍｅｒ，Ｓ．Ｗ．；Ｆｏｑｕｅｔ，Ｍ．；Ｇｒａｉｇｈｅａｄ，　Ｈ．Ｇ．：Ｗｅｂｂ，Ｗ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，２９９：６８２　４５　Ｈａ，Ｔ．：Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．；Ｌｉａｎｇ，Ｊ．；Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｗ．Ｂ．；Ｄｅｎｉｚ，Ａ．Ａ．；　Ｃｈｅｍｌａ，Ｄ．Ｓ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａ　Ｓｃｉ．　Ｓ　Ａ．，１９９９，９６：８９３　４６　Ｚｈｕａｎｇ，Ｘ．；Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｌ．Ｅ．；Ｂａｂｃｏｃｋ，Ｈ．Ｐ．；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．；Ｈａ，Ｔ．；　Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ，Ｄ．；Ｃｈｕ，Ｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８：２０４８　４７　Ｙｕ，Ｃ．；Ｈｕ，Ｄ．；Ｖｏｒｐａｇｅｌ，Ｅ　Ｒ．；Ｌｕ，Ｈ．Ｐ．　Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００３，　１０７：７９４７　４８　Ｌｕｏ，Ｇ．：Ｗａｎｇ，Ｍ．；Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｗ．Ｈ．；Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ．Ｓｃ｝．Ｕ．ｓ．Ａ．。２００７．１０４：１２６１０　４９　Ｅｄｍａｎ，Ｌ．；Ｆ６１ｄｅｓ—Ｐａｐｐ，Ｚ．；Ｗｅｎｎｍａｌｍ，Ｓ．；Ｒｉｇｌｅｒ，Ｒ．Ｃｈｅｍ．　Ｐｈｙｓ．，１９９９，２４７：１１　５０　Ｅｎｇｌｉｓｈ，Ｂ．Ｐ．；Ｍｉｎ，Ｗ．；ｖａｎ　Ｏｉｊｅｎ，Ａ　Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｋ．Ｔ．；Ｌｕｏ，Ｇ．Ｂ．；　Ｓｕｎ，Ｈ．Ｙ．；Ｃｈｅｒａｙｉｌ，Ｂ．Ｊ．；Ｋｏｕ，Ｓ．Ｃ．；Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ１．，　２００６，２：８７１　５１　Ｖｅｌｏｎｉａ，Ｋ．；Ｆｌｏｍｅｎｂｏｍ，Ｏ．；Ｌｏｏｓ，Ｄ．；Ｍａｓｕｏ，Ｓ．；Ｃｏｔｌｅｔ，Ｍ．；　Ｅｎｇｅｌｂｏｒｇｈｓ，Ｙ．；Ｈｏｆｋｅｎｓ，Ｊ．；Ｒｏｗａｎ，Ａ．Ｅ．；Ｋｌａｆｔｅｒ，Ｊ．；Ｎｏｌｔｅ，Ｒ．Ｊ．　Ｍ．；Ｓｃｈｒｙｖｅｒ，Ｆ．Ｃ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１ｎｔ．Ｅｄ盹，２００４，４３：２　５２　Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｌ．；Ｍｅｎｔｅｎ，Ｍ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ，１９１３，４９：３３３　５３　Ｍｉｎ，Ｗ．：Ｊｉａｎｇ，Ｌ．；Ｙｕ，Ｊ．；Ｋｏｕ，Ｓ．Ｃ．；Ｑｉａｎ，Ｈ．；ｇＳｅ，Ｘ．Ｓ．Ｎａｎｏ　Ｌｅｔｔ．，２００５，５：２３７７３　５４　Ｍｉｎ，Ｗ．；Ｘｉｅ，ｘ．Ｓ．；Ｂａｇｃｈｉ，Ｂ．　尸　．ｃ　ｍ．日，２０Ｏ８，１１２：４５４　５５　Ｓａｋ０，Ｙ．；Ｍｉｎ０ｇｈｃｈｉ，Ｓ．；Ｙａｎａｇｉｄａ，Ｔ．Ⅳ口　Ｃ已ｆｌ曰　ｆ．，２０００，２：　ｌ６８　５６　Ｄｅｉｃｈ，Ｊ．；Ｊｕｄｄ，Ｅ　Ｍ．；ＭｃＡｄａｍｓ，Ｈ．Ｈ＿；Ｍｏｅｍｅｒ，Ｗ．Ｅ．ＰｒＤｃ．　．Ⅳ口　Ａｃ以　＆ｆ．　．Ａ．，２ＯＯ４。１Ｏ１：ｌ５９２ｌ　５７　Ｅ１ｔ　Ｊ．；Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．；Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．　ｆ　ｃＰ，２００７，３１６：１ｌ９ｌ　５８　Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．；Ｃｈｏｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．；Ｌｅｅ，Ｎ．Ｋ．；Ｌｉａ，Ｇ．Ａ卅２．Ｒ　．　曰ｆ印　．，２００８，３７：４１７　５９　Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｅ．；Ｃｈａｎｒ皿，ｄ，Ｐ．；Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｍ．；Ｓｈｅｎｏｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．　Ｈｌ；Ｌ０ｎｇ，Ｒ．Ｍ．肘　，２ＯＯ８，２：４３７　６Ｏ　Ｇｏ１ｄｉｎｇ，Ｉ．；Ｐａｕｌｓｓｏｎ，Ｊ．；Ｚａｗｉ１ｓ　，Ｓ．Ｍ．；Ｃｏｘ，Ｅ．Ｃ．　ｆｆ，２ＯＯ５，　１２３：１０２６　６ｌ　Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｇ．　７　Ｄ　ＢｆＤｆ．，１９７５，７１：５８７　６２　Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．Ａ６　彻ｃ　妒　坩Ｄ，ｆ胁ＡｍＰｒｆ∞　ｍ　Ｄｃｆ已　１９７５，ｌ７Ｏ：３７　６３　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．　ｃ　．Ａｍ．，１９７６，２３４：６４　６４　Ｖｏｎ　Ｈｉｐｐｅ１，Ｐ．Ｈ．；Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｇ．Ｉ，．ＢｆＤｆ　ｌ：　ｅｍ．，１９８９，１６４：６７５　６５　Ｊａｃ０ｂ，Ｆ．；Ｍｏｎｏｄ，Ｊ．　肘Ｄ正ＢｆＤｆ．，１９６１，３：３ｌ８　６６　Ｃｈｏｉ，Ｐ．Ｊ．；Ｃａｉ，Ｌ；Ｆｒｉｅｄａ，Ｋ．；ｘｉｅ，Ｓ．＆　ｎｃＰ，２Ｏ０８，３２２：４４２