β—胡萝卜素／介孔纳米材料新型载药体系的制备与稳定性研究

β—胡萝卜素／介孔纳米材料新型载药体系的制备与稳定性研究

以1，3，5-三甲基苯（1，3，5-TMB）作为扩孔剂，对介孔纳米材料MCM-41（mobil company of matter）进行了扩孔改性，采用有机溶剂浸渍法将非水溶性的β-胡萝卜素载入到扩孔后的MCM-41的介孔孔道中，得到了β-胡萝卜素/MCM-41新型载药体系。分别利用TEM，FT-IR，元素分析和低温N2吸附-解吸附对MCM-41以及载药体系进行了表征;研究了载药体系中β-胡萝卜素的最佳载药时间，载药量以及体外稳定性等。通过表征，发现采用水热合成法制备的MCM-41具有良好的球形度，规则的孔径结构;扩孔改性后的MCM-41作为药物载体具有较短的载药时间且药物的载药量有明显提高，并且组装体中β-胡萝卜素的稳定性得到了一定程度的改善。该新型载药体系的研究为β-胡萝卜素的广泛应用提供了新的思路。

标签： 扩孔改性;MCM-41;β-胡萝卜素;稳定性

Preparation and stability of β-carotene loaded using mesoporous silica

nanoparticles as carriers system

LIU Jing， REN Zhi-hui， WANG Hai-yuan， JIN Xing-hua*

（School of Pharmaceutical Science and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China）

[Abstract] 1，3，5-Trimethylbenzene （1，3，5-TMB） was used as the pore-enlarging modifier to expand the pore size of MCM-41 （mobil company of matter） mesoporous silica nanoparticles. The solvent impregnation method was adopted to assemble non-water-soluble β-carotene into the pore channel of MCM-41. The MCM-41 and drug assemblies were characterized by TEM， FT-IR， elemental analysis and N2 adsorption-desorption. The results showed that MCM-41 has good sphericity and regular pore structure.The research also investigated the optimal loading time， the drug loading and the vitro stability of the β-carotene. As a drug carrier， the modified MCM-41 showing a shorter drug loading time， the drug loading as high as 85.58% and the stability of β-carotene in drug assemblies has improved. The study of this new formulation provides a new way for β-carotene application.

[Key words] pore-enlarged modification; MCM-41; β-carotene; atability

doi：10.4268/cjcmm20151812

β-胡萝卜素是应用最为广泛的天然食品着色剂[1]，它既是天然色素，又是人体健康必不可少的一类化合物[2]。β-胡萝卜素分子中存在多个共轭双键结构，对

许多物理、化学、生物等因素都不稳定，例如光辐射、高温、酸、碱、游离卤素、水分等，但氧是影响β-胡萝卜素稳定性的最主要因素[3-4]。因此寻找增加其载药量和稳定性的药物载体具有十分重大的意义。由于介孔纳米材料MCM-41具有比表面积大、无毒副作用、生物兼容性良好等特点[5-7]，故本实验考虑采用MCM-41来包载β-胡萝卜素以增加其生物利用度。

研究发现，将MCM-41作为药物载体的研究中多采用难溶性的小分子作为模型药物，而脂溶性很强、分子体积较大的药物对于MCM-41的选择性更高。由于介孔纳米材料MCM-41具有择形选择性，所以本研究采用1，3，5-TMB作为扩孔改性剂，对介孔分子筛MCM-41的孔径进行精心的调变，使β-胡萝卜素分子的大小能够与分子筛的孔道大小与形状相匹配，以增加β-胡萝卜素的载药量，并在一定程度上改善β-胡萝卜素体外稳定性，为介孔纳米材料作为非水溶性药物的载体展开新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

β-胡萝卜素（纯度>82%，天津光复精细化工研究所）;正硅酸乙酯（TEOS）（分析纯，天津市博迪化工有限公司）;十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（分析纯，天津光复精细化工研究所）;NaOH（分析纯，天津市江天化工技术有限公司）;超纯水（Milli-Q Academic）;甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司）;氯仿、丙酮、无水乙醇等均为分析纯。

Agilent Cary 60紫外分光光度计，Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;Anke TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;Mettler toledo XS105型电子天平（美国Mettler公司）;SX2-4-10马弗炉（天津天有利科技有限公司）。1.2 MCM-41的合成[8]

制备MCM-41的各原料CTAB，TEOS，NaOH，H2O的摩尔比为1∶7.564∶2.551∶4 652。具体制备过程如下：用量筒量取360 mL超纯水置于500 mL三口瓶中，加热到80 ℃后，在搅拌的条件下，向三口瓶中加入1.5 g CTAB，搅拌均匀后加入2 mol·L-1 NaOH溶液5.25 mL，搅拌反应3 min，溶液呈均相后，缓慢加入7.5 mL TEOS，保持80 ℃，不断搅拌反应2 h。反应后溶液冷却至室温，抽滤泵抽滤，并分别用水和无水乙醇洗涤3次，65 ℃下过夜干燥。将得到的MCM-41放入马弗炉中，550 ℃下煅烧5 h，得到MCM-41，并标记为M0。

1.3 MCM-41的扩孔改性

各原料CTAB，TMB，TEOS，NaOH，H2O的摩尔比为1∶2∶7.564∶2.551∶4 652（y/x=1，2，3）。具体制备过程如下：用量筒量取360 mL超纯水置于500 mL三口瓶中，加热到80 ℃后，在搅拌的条件下，向三口瓶中加入1.5 g CTAB，搅拌均匀后加入2 mol·L-1 NaOH溶液5.25 mL（pH 10.5），搅拌反应3 min，溶液呈均相后，向三口瓶中加入0.6 mL扩孔剂1，3，5-TMB，并缓慢加入7.5 mL TEOS，

保持80 ℃温度下，不断搅拌反应2 h。反应液冷却至室温，将产物过滤、洗涤（无水乙醇、超纯水各洗涤3次），105 ℃下过夜干燥。将得到的MCM-41放入马弗炉中，550 ℃下煅烧5.5 h，得到大孔径的MCM-41成品，并标记为M1。

1.3.1 β-胡萝卜素在介孔纳米材料MCM-41中的组装 β-胡萝卜素的组装采用有机溶剂浸渍法。称取50 mg M0及M1分别加入到有机溶剂中，密封，避光，放入37 ℃恒温震荡器中震荡一定时间后，9 000 r·min-1离心5 min，取上清，用紫外分光光度测定β-胡萝卜素的载药量，β-胡萝卜素的最大吸收波长为445 nm。β-胡萝卜素的载药量（DL）=（Ct-Cf）/（Ct-Cf+C0）×100%，式中，Cf为离心后上清液中剩余的β-胡萝卜素的含量，Ct为加入的β-胡萝卜素的总含量，C0为介孔材料的质量。

载药后得到了β-胡萝卜素/MCM-41载药体系，经9 000 r·min-1离心5 min，收集下层沉淀，将收集到的粉末密封，避光保存于真空干燥器中，备用。

1.3.2 浸渍溶剂的选择 本研究考察了氯仿、丙酮、二氯甲烷、氯仿-丙酮（9∶1）对于β-胡萝卜素载药量的影响。设定β-胡萝卜素-MCM-41（1∶1），于37 ℃恒温震荡器中震荡24 h。离心，吸取上清液，测定β-胡萝卜素的载药量。

1.3.3 β-胡萝卜素标准曲线的建立 配制β-胡萝卜素标准溶液，质量浓度分别为0.5，1，2，3，4，5 mg·L-1。以浸渍溶剂作为空白，紫外扫描范围300～650 nm，在446 nm处β-胡萝卜素有最大吸收。标准曲线方程A=0.231 6C+0.001 5，R2=0.999 5，线性范围0.5～5 mg·L-1。

1.3.4 最大载药量的确定 将50 mg M1置于1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 g·L-1的50 mL β-胡萝卜素氯仿-丙酮（9∶1）溶液中，搅拌24 h，过滤，9 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，稀释后利用紫外分光光度法测定β-胡萝卜素的残留量，计算出药物组装体中β-胡萝卜素的含量。

1.3.5 最佳载药时间的确定 将50 mg M1置于4.0 g·L-1的β-胡萝卜素氯仿-丙酮（9∶1）50 mL溶液中，搅拌2，4，8，10，21，24 h，过滤，9 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，稀释后利用紫外分光光度法测定β-胡萝卜素的残留量，计算出药物组装体中β-胡萝卜素的含量。

1.4 药物组装体中β-胡萝卜素稳定性的测定

分别将50 mg β-胡萝卜素、β-胡萝卜素/MCM-41的载药体系（包括扩孔前与扩孔后的载药体系）避光、敞口放置于30 ℃下，每天取样观察，并利用HPLC测定β-胡萝卜素的含量。

精密称定2 mg上述待测β-胡萝卜素/MCM-41载药体系的粉末，加入1.0 mL 氯仿，超声使载药体系中的β-胡萝卜素浸出。9 000 r·min-1离心5 min，将上清液转移至5 mL量瓶中。下层固体中再次加入1.0 mL氯仿，进行二次提取。反复提取β-胡萝卜素3次，合并上清液，用氯仿定容至5 mL，获得β-胡萝卜素提取

液。利用高效液相色谱法进行测定，从而得出储存过程中制剂中β-胡萝卜素的含量，β-胡萝卜素的保留率（RR）=An/A0×100%，式中，An为储存第n天后组装体中β-胡萝卜素的峰面积，A0为第0天组装体中β-胡萝卜素的峰面积。

HPLC测定β-胡萝卜素的液相条件[12]：Agilent ZORBAX-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;检测波长445 nm;流动相100%甲醇;柱温25 ℃。

2 结果与讨论

2.1 MCM-41的表征

2.1.1 透射电子显微镜（TEM） 煅烧去除模板后的介孔分子筛M0和经过扩孔改性后得到的介孔纳米材料M1透射电子显微镜图片见图1。合成的MCM-41呈球形，其粒径大约分布在200～300 nm，且球形均匀。经过扩孔改性后的MCM-41仍然保持着良好的球形形貌，这说明扩孔改性剂没有对介孔分子筛的形貌产生影响。2.1.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR） M0与M1在去除模板后的傅里叶变换红外光谱图见图2，波数区间为400～4 000 cm-1。在图谱上，3 421 cm-1处的吸收峰为Si-OH和吸附水分子的特征峰;与硅骨架有关的谱峰出现在1 096，810 cm-1，分别为硅氧键Si-O-Si不对称与对称伸缩振动;460 cm-1处的谱峰为Si-O键的弯曲振动。从以上分析可知，孔改性后的介孔分子筛M1仍保持良好的介孔孔道结构。

2.1.3 N2吸附-解吸附 M0，M1的N2吸附-解吸附等温线图见图3。M0，M1均呈现典型的Ⅵ型等温线特征，这说明致孔剂的加入没有改变材料的孔道结构，材料均具有圆柱形细长孔道结构。当P/P0为0.2～0.4时，M0和M1的N2吸附量均迅速增加，出现一个突跃，这是N2在介孔内产生的毛细凝聚所致，吸附量的迅速增加表明介孔结构的存在且孔径均匀。经过扩孔改性后的MCM-41吸附量明显增加，M0和M1的结构参数证实了经过扩孔改性后得到的M1，孔径增加，比表面积减小，见表1。

滞后环的大小反映了孔径分布的宽窄。在吸附过程中，孔径较窄的中孔内首先发生毛细凝聚，孔径较宽的孔内最后发生毛细凝聚;而在脱附过程中，由于孔中凝聚的液体的相平衡压力与孔径尺寸成正比，所以相对压力较高时，宽孔中的液体首先脱附，而窄孔中的液体只有在相对压力降到足够低时才能脱附。由此可推测，滞后环上下端闭合的早晚反应样品中孔径分布的宽窄，上下两端闭合点相距越远，孔径分布越宽;反之，上下两端闭合点相距越近，孔径分布越窄[10]。对比图3a和图3b可以发现， M1的滞后环比M0的滞后环要大，且上下两端闭合点相距稍远，说明加入扩孔剂之后制备的MCM-41孔径分布变宽。原因主要是，将1，3，5-TMB作为扩孔剂添加到反应混合物中时，1，3，5-TMB会进入表面活性剂的憎水基团内部，使胶束的体积因其填充而增大，从而达到增大孔尺寸的目的，但随着TMB添加量的增加，其在胶束内部的分散程度不完全均一，就会导致合成的MCM-41孔径分布变宽[11]。

2.2 药物组装体的表征

2.2.1 元素分析 为了证实β-胡萝卜素成功载入到介孔材料内，对组装β-胡萝卜素后的纳米材料样品中碳（C）和氮（N）元素含量进行分析。在组装β-胡萝卜素后，对比β-胡萝卜素/M0和β-胡萝卜素/M1中的C含量可以发现，β-胡萝卜素/M0中的C含量虽有增加，但增加量不如β-胡萝卜素/M1，见表2。可以推断出，增加的C含量主要来自于β-胡萝卜素，同时经过扩孔后得到的MCM-41能够负载更多的β-胡萝卜素，说明孔径扩大后，使更多的β-胡萝卜素能够进入到介孔孔道内，初步证明了β-胡萝卜素已成功负载到介孔材料中。

2.2.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR） 介孔材料组装β-胡萝卜素后的红外谱图见图4。波数区间400～4 000 cm-1。组装β-胡萝卜素后的M1在1 080，810，460 cm-1附近处均出现了硅基介孔材料骨架结构的吸收峰，说明组装β-胡萝卜素后介孔材料的结构没有发生变化。在β-胡萝卜素/M1的红外谱图上，3 000 cm-1附近出现了β-胡萝卜素的特征吸收峰，进一步证明β-胡萝卜素已经组装到介孔材料上。

2.3 浸渍溶剂的选择

本文考察了4种常见的浸渍溶剂：氯仿、丙酮、二氯甲烷以及氯仿-丙酮（9∶1）对于β-胡萝卜素载药量的影响，结果见图5。浸渍溶剂对于β-胡萝卜素的溶解度及溶剂的介电常数见表3。浸渍溶剂筛选的原则主要是在对β-胡萝卜素有一定溶解度的基础上，恰当的溶剂介电常数能够增加溶剂在介孔分子筛中的渗透性，因此筛选出合适的介电常数的溶剂有利于提高β-胡萝卜素的载药量[13-14]。当采用丙酮作为浸渍溶剂时，虽然丙酮的极性较大，但对β-胡萝卜素的溶解度较低，故β-胡萝卜素的包封率低;当采用二氯甲烷作为浸渍溶剂时，虽然二氯甲烷的极性比较适中，但是β-胡萝卜素在二氯甲烷中的溶解度大，β-胡萝卜素与二氯甲烷的相互作用较强，使得其很难在介孔分子筛与溶剂之间达到分配平衡，β-胡萝卜素的包封率较低;当采用三氯甲烷作为溶剂时，由于其溶解性适中，只是极性略小，得到的β-胡萝卜素的载药量已经有较大程度的提高，但为了进一步提高三氯甲烷作为浸渍溶剂时β-胡萝卜素的载药量，选择采用混合溶剂，将三氯甲烷与丙酮按9∶1混合，在尽可能保持β-胡萝卜素在混合溶剂中的溶解度的前提下，改善三氯甲烷的极性，提高β-胡萝卜素的载药率。

2.4 β-胡萝卜素载药量的测定

β-胡萝卜素的浓度与β-胡萝卜素载药量的关系曲线见图6。当M1为50 mg时，β-胡萝卜素的载药量随β-胡萝卜素浓度的增加而增大。当β-胡萝卜素溶液中β-胡萝卜素的总量达到200 mg（此时，β-胡萝卜素溶液的质量浓度为4.0 g·L-1）时，β-胡萝卜素的载药量基本保持不变。这是由于当增加β-胡萝卜素与MCM-41质量比时，介孔孔道内外的β-胡萝卜素的浓度差逐渐增大，则进入到介孔孔道中的β-胡萝卜素也随之增加。然而，β-胡萝卜素的浓度越大，由于MCM-41巨大的比表面积，β-胡萝卜素会吸附于MCM-41的表面而未能进入到介孔孔道中，则会造成测定的β-胡萝卜素的载药量不准确。因此，4.0 g·L-1为β-胡萝卜素最佳组装浓度。载药时间与β-胡萝卜素载药量的关系曲线见图7。当M1与β-胡萝

卜素的投药比为1∶4，载药时间<16 h时，β-胡萝卜素与MCM-41之间的吸附-解吸附过程没有达到平衡，故进入到MCM-41孔道内的β-胡萝卜素量比较少，载药量较低;当载药时间在16 h左右时，曲线发生突跃，这可能是由于MCM-41的介孔孔径与β-胡萝卜素分子之间的吸附-解吸附过程达到平衡，β-胡萝卜素分子开始进入到介孔孔道内，故当载药时间>16 h，β-胡萝卜素的载药量逐渐增加，24 h以后，β-胡萝卜素的载药量略有降低，可能的原因是介孔孔道是开放性孔道，载药时间过长会导致β-胡萝卜素的泄漏。

通过比较图7b与图7a发现，β-胡萝卜素与M0达到吸附-解吸附平衡所需的时间更长。这是由于M0的孔径大小与β-胡萝卜素的分子大小匹配度低于M1，β-胡萝卜素难以进入到M0的介孔孔道内，故平衡时间更长，载药量低于β-胡萝卜素/M1组装体。因此，24 h为M1组装β-胡萝卜素的最佳时间。

2.5 MCM-41包封β-胡萝卜素的稳定性

将β-胡萝卜素及β-胡萝卜素/MCM-41组装体避光、敞口放置于30 ℃下，在贮藏期间β-胡萝卜素保留率的变化过程见图8。由于在贮藏期间β-胡萝卜素及β-胡萝卜素/MCM-41组装体受到氧气、水分等因素的综合影响，β-胡萝卜素发生了降解;当没有被组装时，β-胡萝卜素完全暴露于空气中，降解的速率较快。

当β-胡萝卜素与M0进行组装后，相比于空白的β-胡萝卜素，发现β-胡萝卜素的降解速度更快，见图8b，这可能是由于此时未加入扩孔剂，所以只能够将很少的β-胡萝卜素载入到介孔孔道的内部，大部分的β-胡萝卜素仅仅是被吸附于介孔分子筛的表面，又由于介孔分子筛具有巨大的比表面积，促进了β-胡萝卜素与空气中的氧气接触，因此更加快了β-胡萝卜素的降解速率。

当β-胡萝卜素与M1进行组装后，β-胡萝卜素的降解速率明显降低，见图8c，说明此时的孔径能够与β-胡萝卜素分子大小形状相匹配，β-胡萝卜素被组装进入了介孔孔道内，少部分β-胡萝卜素吸附于介孔表面，故开始时β-胡萝卜素降解较快;但由于介孔孔道能够将β-胡萝卜素与外界环境隔离，所以组装于介孔孔道内部的β-胡萝卜素能够减少并尽量避免与空气中的氧气及水分接触，降解速率减慢，提高了β-胡萝卜素的稳定性。

3 结论

通过1，3，5-TMB扩孔改性制备的介孔纳米材料MCM-41具有规则的孔道结构，合适的孔径，可以作为β-胡萝卜素的药物载体。经过组装，得到了既能保证载体的高载药性，又能有效地提高β-胡萝卜素稳定性的β-胡萝卜素/MCM-41新型载药。该新型制剂的研究对于提高β-胡萝卜素的生物利用度具有十分重要的意义。本课题研究了介孔分子筛MCM-41作为药物载体的潜在应用，为β-胡萝卜素的广泛应用提供了实验依据。

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