猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的细胞病理学研究

闫清源;周书亭;谢洋洋;丁思嘉;郑煜明;罗依然;华修国;杨志彪

【摘 要】Transmission electron microscope (TEM) was employed to investigate the pathological changes in Vero cells infected by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).It is observed that at the incipient phase of the infection (6 h),though with intact cellular structure,part of mitochondria and rough endoplasmic retiulums expanded,cytoplasm vacuolization emerged.With the infection lasting (12 h),the virus particles gradually increased,more vacuolar structures appeared in cytoplasm,and virus particles successively appeared in cytoplasm and nuclei.As infection lasting 24 hours,with an observably increasing viron amount,the

mitochondria vacuolization and cell fusion became more prominent,even nucleus lysis was observed.At the final phase of infection (48 h),with severe vacuolization,nuclear condensation and cell infusion,the neonatal PEDV virons were budding from the infected Vero cells.All the results above laid a data foundation for unveiling the infection and pathogenic mechanism of PEDV.%对感染猪流行性腹泻病毒(PEDV)的Vero细胞进行透射电镜观察发现:在病毒感染初期(6 h),尽管细胞结构完整,部分细胞线粒体、粗面内质网扩张,胞浆出现空泡;随着感染时间的增长(12 h),病毒粒子逐渐增多,细胞质内出现较多空泡状结构,病毒粒子先后出现在胞浆及细胞核内部;感染24 h后,病毒粒子数目显著增多,空泡化明显,出现细胞核分解,细胞融合更加明显;感染最后阶段(48 h),空泡化严重,核质固缩,细胞间大量融合,病毒粒子出芽排出.以上结果,为揭示猪流行性腹泻病毒的感染与致病机制积累了数据.

【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》 【年(卷),期】2018(036)002 【总页数】4页(P39-42)

【关键词】猪流行性腹泻病毒;Vero细胞;细胞病理学

【作 者】闫清源;周书亭;谢洋洋;丁思嘉;郑煜明;罗依然;华修国;杨志彪

【作者单位】上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海海洋大学 水产与生命学院,上海 201306;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240;上海交通大学 农业与生物学院,上海市兽医生物技术重点实验室,上海 200240 【正文语种】中 文

【中图分类】S858.28;S852.659.2

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)通过粪口途径或其他接触性方式传播,主要侵害猪胃肠道,引起剧烈呕吐、水样腹泻和高度脱水等特征性临床症状[1]。PEDV为冠状病毒属(coronavirus)成员[2],病毒粒子多呈球形,直径为95～190 nm,平均130

nm,囊膜外侧有花瓣状纤维突起,纤维突起长18～23 nm。猪流行性腹泻近年来在我国呈地方流行态势,逐渐成为养猪业发展的瓶颈[3]。但其致病机制尚不明确,为此,有必要研究被PEDV入侵后的细胞病理变化,为进一步探讨细胞损伤在PEDV发病机制中的作用,提供形态学的依据。遇秀玲等人[4]用胎猪肠单层细胞培养PEDV并制备超薄切片,在电镜下观察到病毒呈圆形或椭圆形,接毒经一定时间后,大量病毒逸入胞浆内,并通过膜融合方式被吐出细胞外。但对PEDV的易感细胞Vero细胞的细胞病理学研究报道很少。施雯等[5]虽然也报道了PEDV感染Vero细胞的超微结构变化,但是并没有观察病毒感染早期(24 h之内)的病变。根据实验观察,PEDV在Vero细胞接毒6 h后侵入细胞,推测其超微结构会发生明显的病变。为进一步研究PEDV感染Vero后病毒增殖情况及变化规律,本实验利用超薄切片和透射电镜技术观察感染细胞不同时间的超微结构变化,分析PEDV在细胞内的增殖特点,为PEDV的感染和致病机制研究提供数据。 1 材料与方法 1.1 细胞及毒株

Vero细胞,PEDV SHpd/2012株,均由上海交通大学人兽共患病与比较医学实验室保存。 1.2 主要仪器

4111型水套式CO2培养箱(Thermo fisher,美国),Tecnai G2 120KV生物型透射电镜(FEI,中国香港)。 1.3 细胞培养及接毒

将在T75培养瓶内生长良好的Vero细胞弃去培养液,用PBS液清洗细胞2遍,加入含终浓度5 μg/mL胰蛋白酶(trypsin)的DMEM,以MOI=0.5接种病毒原液[6]。同时设有2组对照,一组为不接种病毒且不含胰蛋白酶的细胞培养物,一组为不接种病毒而含同浓度胰蛋白酶的细胞培养物,在接种后6、12、24、48 h分别在倒置显

微镜下观察细胞生长及细胞病变(CPE)情况。 1.4 PEDV感染Vero细胞超薄切片的制备及电镜观察

取接毒6、12、24、48 h的Vero细胞,弃去培养液,用细胞刮刀小心将单层贴壁细胞从细胞瓶上刮下,收集至1.5 mL EP管中,1 200 r/min离心5 min;用PBS漂洗3次,每次5 min,弃上清液,收集沉淀,加入2.5% 4 ℃预冷的戊二醛溶液,过夜固定。然后每例样品加锇酸0.4 mL,树脂0.4 mL。0.1 mol/L PB漂洗15 min/次,4次,用2%锇酸与0.2 mol/L PB等比例配制1%锇酸,处理2 h,接着用0.1 mol/L PB漂洗15 min/次,4次,50%和70%乙醇各处理10 min,90%乙醇与90%丙酮等比例混合处理15 min,90%丙酮处理15 min,将溶液置于速度100 r/min的摇床上,用100%丙酮处理3次,每次10 min,丙酮:环氧树脂(1∶1)处理1 h,丙酮∶环氧树脂(1∶2)过夜处理。第2天置换一次纯树脂,7 h后,将样品放置于60 ℃ 烘箱聚合48 h。用超薄切片机进行超薄切片,厚度 70 nm,用Tecnai G2 120KV生物型透射电镜观察并拍照。 2 结果

2.1 PEDV感染Vero细胞后6、12、24、48 h的透射电镜观察

当PEDV感染细胞6 h后,部分细胞的线粒体、粗面内质网及核周隙出现扩张,出现变性,但是细胞仍然完整(图1A),溶酶体的分泌物增加,细胞浆内出现空泡(图1B),有少数细胞开始出现病变,细胞变圆,细胞的核仁明显(图1C);感染12 h后,病毒部分散在分布于胞浆内,也可见分布于粗面内质网或空泡状结构中(图1D),病毒颗粒处于细胞膜附近,正在向细胞内部转移,可清晰地看出,病毒颗粒呈圆形,有些略呈卵圆形,表面有致密的双层质膜包绕,膜内为较疏松的核心,膜外有放射状排列的纤细突起(图1E),变圆的细胞数目增多,有膜融合的趋势(图1F)。感染24 h后,病毒颗粒数量明显增多,细胞空泡增多,出现细胞核分解(图1G),细胞融合的现象更加明显(图1H),病毒在空泡内,且繁殖的数目较多(图1I)。感染48 h后,细胞的空泡化现象严重,核质固

缩,细胞内容物流失严重,细胞间大量融合(图1J),图1K是放大的空泡和细胞的破碎现象,病毒颗粒在细胞内复制后以出芽的方式排出,细胞发生脱落(图1L)。 图1 PEDV感染Vero 细胞的透射电镜观察 A.线粒体、粗面内质网出现空泡化,核周隙扩张,6 h;B.细胞浆内部出现空泡,溶酶体活跃,6 h;C.细胞变圆,核仁大而明显,6 h;D.病毒散在 分布于空泡中或细胞浆中,12 h;E.形态结构鲜明的的病毒分布于空泡、内质网中,并正在跨过核膜向细胞核内部转移,12 h;F.细胞普遍变圆, 有的细胞间开始出现膜融合,12 h;G.细胞内部空泡增多,病毒粒子数目增多,核孔增大,核仁裂解松散,24 h;H.细胞融合加剧,24 h;I.病毒粒 子广泛分布于空泡内,密集程度加大,24 h;J.细胞的核仁完全裂解消失,核内容物流失,空泡化现象严重,细胞间大量融合,48 h;K.放大的细 胞内部空泡,48 h;L.病毒粒子以出芽的方式排出细胞,细胞脱落,48 h;M.未经任何处理过的细胞;N.未经任何处理过的细胞;O.加胰蛋白 酶处理,细胞变圆;P.加胰蛋白酶处理,细胞内部出现大量溶酶体的分泌物;图中箭头所指为相应简写字母所对应的结构。 缩写说明:CM:细胞膜;ER:内质网;M:线粒体;N:细胞核;V:空泡;VS:病毒;LY:溶酶体Fig.1 PEDV infected Vero cells under transmission electron microscope A.Mitochondria,rough endoplasmic reticulum vacuolated and perinuclear space enlarged,6 h;B.Vacuoles emerged in the cytoplasm and lysosome was activated,6 h;C.The cells became round,cell nucleus became big and clear,6 h;D.Virions scattered into the vacuoles and cytoplasm,12 h;E.Virions with sharp morphostructur scattered into the vacuoles and rough endoplasmic reticulum,as were transfering into cell nucleus through the karyotheca,12 h;F.Cells became round numerously,some began cell-to-cell fusing,12 h;G.The number of vacuoles amd virion increased,the nucleopores enlarged,and nucleolus split,24 h;H.Cell-to -cell fusion intensifid,24 h;I.Virions spread intro vacuoles widely and density

increased,24 h;J.Nucleopores split thouroughly,inclusions of nuclear ran off,vacuolation became severe and cell-to-cell fused at a large scale,48 h;K.Vacuoles became enormous,48 h;L.Virions released by budding, and cells shed,48 h;M.untreated cells;N.untreated cells;O.Treated with trypsin,cells became round;P.Treated with trypsine,plentiful secreta of lysosome emerged inside the cells;Arrows pointed to the corresponding cellular structure. Acronym:CM:cell membrane;ER:endoplasmic reticulum;M:mitochondria;N:nucleus;V:vacuole;VS:virus;LY:lysosome 2.2 未经PEDV感染的空白对照组

未经任何处理的空白对照细胞,仅作对照(图1M、N),加胰蛋白酶处理的空白对照细胞(图1O、P),加胰蛋白酶之后,胰蛋白酶作为外来异物使细胞发生病变,溶酶体活动加强,细胞变圆(图1O),溶酶体的分泌物明显增加(图1P)。 3 讨论

目前国内对PEDV感染细胞的超微结构的研究和分离毒株的病毒形态学大多仅局限于病毒的形态特征。本研究同时在透射电镜下观察病毒的形态,以及对易感细胞造成的损伤情况,有助于理解PEDV感染与致病机制。

本研究使用透射电镜对感染PEDV的Vero细胞进行观察,可见病毒粒子成堆或成串聚集在细胞浆内,呈圆形或椭圆形,部分呈中空状,多呈致密核芯,直径为60～120 nm。在病毒感染初期,病毒粒子无明显变化,成堆或成串聚集在细胞质内。随着感染时间的增长,线粒体、内质网等出现肿胀变形,并且细胞浆内溶酶体活跃,导致线粒体溶解,随之在细胞质内形成较多空泡状的结构。病毒感染24 h后,细胞浆浓缩,出现大量的空泡,在粗面内质网周围可以看到大量的病毒颗粒,并且粗面内质网出现肿胀、扩张现象,但是在细胞膜和细胞核上没有发现病毒复制的迹象,因此推测粗面内质网是PEDV复制、增殖的主要细胞器。此推测与冠状病毒复制于粗面内质网中

的双层膜性囊泡(DMVs)的观点相一致[8]。PEDV感染后,损伤线粒体嵴机构,导致线粒体空泡化,可能是病毒旨在阻止细胞本身对病毒入侵的应答机制[9]。感染的最后阶段即感染48 h之后,细胞核浓缩,细胞核膜破裂,细胞器溶解,细胞内部结构不清,整个细胞严重破碎,发生脱落。但仍旧可见有大量病毒粒子聚集在细胞浆内未释放出来,这有可能是PEDV在细胞培养繁殖效率低、分离培养难度大的原因之一。 实验组中采用Vero细胞进行连续传代培养,根据前人经验[10],在营养液中需加入一定量的胰蛋白酶促进病毒对细胞的吸附感染,提高病毒的细胞适应性。研究表明,蛋白酶具有促进PEDV感染细胞间的融合,纤突蛋白的激活以及病毒粒子的释放的重要作用[11- 12]。但胰蛋白酶浓度过高也会对细胞造成一定的损伤,可能导致大量病毒仍然聚集在细胞浆内无法释放出来,再加之细胞崩解破碎,从而影响病毒粒子在细胞内部的繁殖效率。另外,推测在细胞的培养过程中,由于二氧化碳不断生成,导致培养液的pH降低,使宿主细胞不能满足病毒在细胞内复制所需要的能量及蛋白质合成的条件,从而抑制病毒在细胞内部的增殖及释放。最后,PEDV感染细胞后,可导致宿主细胞的凋亡,而宿主细胞的过早死亡对病毒复制和建立持续感染具有负面的影响。 参考文献:

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