骨髓间充质干细胞研究进展

【综述与进展】

骨髓间充质干细胞研究进展

梁丽玲(综述),杨庭树(审校)

【主题词】　骨髓细胞;间质干细胞;细胞分化

【中图分类号】　R329.28　　　　　【文献标识码】　A　　　　　【文章编号】　1009-6647(2006)06-1026-03　　骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedMesenchymalstemcells,骨髓MSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSC)之外的另一类干细胞,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆,因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast,CFU-F)。又由于它们来自骨髓的支持结构,并作为滋养层支持造血干细胞的生长,因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)。近年来,随着组织干细胞研究的兴起,特别是对组织干细胞可塑性的深入研究,使得骨髓MSCs的发育潜能、体外分离、纯化、诱导分化方法等的研究有了很大进展。同时,由于骨髓MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点,使其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景。

1　骨髓MSCs的生物学特性

不同物种的骨髓MSCs体外培养的形态学特征大致相同,主要表现为梭形、纺锤形,少数为多角形。目前,骨髓MSCs的分离方法主要有以下几种:(1)贴壁法:主要根据骨髓MSCs的贴壁生长特性来实现分离。此法虽相对粗糙,但操作简易,分离到的细胞分化潜能较好,被广泛采用;(2)密度梯度离心法:主要根据骨髓中细胞成分的比重不同,清除红细胞,分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。普遍采用Ficoll或Percoll进行密度梯度离心。值得注意的是,不同密度的分离液对MSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的MSCs大小均匀,纯度较高,也被广泛采用;(3)细胞表面分子标记分选法:主要是根据骨髓一般采用流式细胞仪、免疫MSCs的细胞表面分子特征来分离。

磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到骨髓MSCs特异性的细胞表面标记,该法较少采用;(4)细胞筛选法:主要是根据细胞大小来实现分离。利用一种有3󰀁m小孔的塑料培养皿从骨髓中筛选骨髓MSCs。

骨髓MSCs含量很低,只占骨髓有核细胞总数的0.001%～0.01%,并且随着年龄的增加或体质的衰弱,细胞的数量会逐渐减少,因此要获得足量的骨髓MSCs,必须在体外进行大量扩增。目前,认为以下因素是影响骨髓MSCs扩增的主要因素:(1)血清:血清对大量扩增骨髓MSCs起着重要的作用,不同浓度的血清对培养骨髓MSCs纯度的影响亦较大,常用10%的胎牛血清培养骨髓MSCs。(2)接种密度:骨髓MSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关,一般认为较低密度种植有益于增

2　骨髓MSCs的可塑性

现研究表明,来源于中胚层的骨髓MSCs可跨越胚层界限,也可向来源于内胚层及外胚层的组织、细胞分化,即骨髓MSCs具有可塑性。近20a来关于骨髓MSCs可塑性的研究成果为其最终应用于疾病的临床治疗打下了坚实的基础。2.1　向成骨细胞分化　MSC向成骨细胞的分化最早为人所注意,在异基因骨髓移植的实验犬,获得造血重建后却因肺的广泛骨化而死于呼吸衰竭。将狗的MSCs在体外培养扩增后,贴附在生物材料上,细胞分泌骨基质,成骨分化很快。人的MSCs用上述同样方法修复成年无胸腺大鼠骨损伤,也得到较好效果。采用密度梯度离心先从成人骨髓中分离出MSCs,然后在-磷酸甘油和抗坏血酸等单MSCs培养体系中加入地塞米松、󰀂独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞[1]。

2.2　向软骨细胞分化　人和动物的骨髓MSCs在多种生长因子、细胞因子的作用下可向软骨细胞分化。以Ⅰ型胶原凝胶为载体材料复合骨髓MSCs修复全骺软骨缺损,证实正常关节软骨形成。活体实验表明,诱导分化的软骨细胞植入体内可获得软骨缺损的修复。通过单层培养分离得到的兔MSCs,转入试管中形成聚集体,在含10-7mol/L地塞米松的培养基中培养,经组织染色和免疫组织化学检测,有Ⅱ、Ⅹ型胶原表达,表明MSCs诱导分化成为软骨细胞。

2.3　向脂肪细胞分化　骨髓MSCs在异丁基-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛等的诱导下,可使95%以上的细胞定向分化为脂肪细胞,这些细胞表达过氧化物酶体增殖激活受体 2(PPAR 2)、脂蛋白脂酶(LPL)和脂肪酸结合蛋白(aP2)。MSCs向脂肪分化除了受脂肪酸合成酶的调控外,还受核受体和转录因子PPAR- 的诱导[2]。此外,研究表明,1,25-(OH)2-D3抑制MSCs向脂肪细胞分化。

2.4　向心肌细胞分化　Makino等从小鼠股骨中获得骨髓氮胞苷处理,大约30%的MSCs出现形态学改变,MSCs,经5-分化为类心肌细胞,表达特异性的心房利钠肽(ANP)和脑利钠肽(BNP)基因,并且能与抗肌球蛋白、抗支架蛋白、抗肌纤维蛋

作者单位:解放军总医院心内科,北京100853殖。高密度接种后细胞生长较慢的原因可能是由于细胞间的接触抑制,或细胞释放到培养基中的因子影响了MSCs的生长。(3)细胞因子:一些细胞因子对于维持骨髓MSCs增殖和未分化状态亦十分重要。(4)动物种属:一般认为骨髓MSCs的生长特性相似,但也有资料显示骨髓MSCs生长特点有种属差异。

白的相应抗体结合,电镜检查可观察到特征性的经闰盘连接的中国误诊学杂志2006年3月第6卷第6期　ChinJMisdiagn,Mar2006Vol6No.61027

肌节、中心核和心房颗粒,电生理检测到类窦房结及类心室动作电位,并可重复检测到自主起搏细胞。近来发现将干细胞和心肌细胞混合培养或者将干细胞置于加有心肌细胞提取物的环境中培养也是将干细胞转化为心肌细胞的途径之一[3,4]。2.5　向神经细胞分化　体外诱导MSCs可以变为神经元细胞,表达NSE、NeuN、NF-M和tau等神经标志。在丁羟基苯甲醚或󰀂-巯基乙醇作用下,可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化。用双丁酰环磷腺苷和异丁基甲基黄嘌呤处理MSCs可诱导神经分化早期标记的表达,在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子同样可诱导神经分化早期标记的表达。此外,MSCs在体内也可分化为神经细胞。将人的MSCs注入脑梗死1周后的大鼠大脑或全身应用治疗脑缺血性疾病,发现这些细胞分化为胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元(表达NF160、NF200、NF70、NSE和󰀂-Ⅲ、Ne-uN和MAP2),并能恢复大鼠的感觉运动功能。将纯化的MSCs注射到新生的小鼠的侧脑室,发现MSCs在脑内发生迁移,在海马、嗅球、纹状体等部位可以看到MSCs来源的神经胶质细胞,而不破坏其正常的脑结构。由此可见MSC自体移植治疗神经系统疾病的可行性,这打破了以前认为脑细胞受损后不能再生和功能不能恢复的观点,为中枢神经系统功能重建和再生提供了新的途径。

3　骨髓MSCs的分化调控机制

细胞分化的实质是细胞内基因的选择性表达,导致细胞新的、特异性的蛋白质的合成,从而在生化、结构及功能上发生变化。据近来对细胞生物学分化的研究,认为是多种因素如细胞质和细胞核之间的相互作用、诱导因素和抑制因素的相互制约、激素及多种细胞信号分子形成的信号网络以及细胞本身所处微环境的位置信息等综合影响,诱导相关发育基因在序列上的改变,促使干细胞向不同组织细胞分化,但目前对于这些因素及其所产生的分子信号以及这些信号是如何传递并引起细胞基因的差异性表达还知之甚少。Dio等[6]在骨髓MSC培养体系中加入地塞米松0.1mmol/L、维生素C0.05mmol/L、-甘󰀂油磷酸10mmol/L,诱导成骨分化,用含有23040个基因的cD-NA微阵列系统(基因芯片技术)分析MSC在诱导后第3、15、27天的基因表达差异。结果表明,有55个基因表达增强,82个基因表达受到了抑制。Chedrawy等[7]将骨髓MSC细胞4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记后,注入大鼠心肌,不同时间点取标本切片染色,结果显示:第1周,标记的细胞仍保持未分化状态,4～6周以后,移植细胞分化完全,其结构与正常心肌极相似,且移植细胞的肌纤维方向与宿主心肌纤维平行。表明移植细胞在心肌组织微环境中,其结构发生了适应性的变化,骨髓MSC有随组织环境周围细胞分化的特性。但组织微环境中诱导骨髓MSC分化的因子是什么?在体外实验中,即使同一诱导因子对不同物种的骨髓MSC的诱导效应以及敏感程度亦并非相同。地塞米松诱导人骨髓MSC分化为成骨细胞,但却诱导小鼠骨髓MSC向脂肪细胞分化。而在骨髓中,不仅有间质干细胞,还存在造血干细胞,这本身也意味着不同的干细胞对同一环境中的因子可以作出不同的反应。

[5]

4　临床应用及前景

由于MSCs可以分化为多种细胞,可取自自体骨髓,取材方便,且体外易培养,增殖快,并且由于来源于自体,由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题,亦不涉及伦理道德问题,因此体外培养扩增MSCs可作为组织工程中理想的种子细胞。干细胞治疗可被用于治疗冠状动脉疾病,最近,Wollert等[8]研究结果表明,骨髓MSCs移植治疗明显提高左室功能,而且移植过程安全,不增加主要临床不良事件。在矫形医疗方面,有许多局部移植MSCs的应用例子,如脊椎融合、节段性骨缺损修复和颅骨缺损。关节软骨病灶性缺损修复、脊椎损伤修复也有报道。

此外,骨髓MSCs是比较原始的细胞,其免疫原性较弱,能够抑制混合淋巴细胞反应。异体移植与供体不匹配、宿主免疫排斥或移植物抗宿主反应(GVHD)弱的MSCs的临床应用已有报道。例如,脆骨病(骨发生不全)儿童异体骨髓移植,结果供体源MSCs植活和新骨形成增加;异体骨髓MSCs注射到异染性脑白质营养不良患者发现没有反应性异常T-细胞出现和GVHD发生[9]。异体移植骨髓MSCs在重度特发性再生障碍性贫血患者中植活也被证明,具有改善骨髓基质功能的作用[10]。异基因移植的骨髓MSC不仅具有多向分化能力,而且具有特殊的免疫耐受性,能够在异基因环境中存活。这为应用骨髓MSC进行基因治疗以及移植骨髓MSC替代治疗受损组织提供了可能。

近年来,随着转基因技术的发展,MSCs已成为基因操作的干细胞平台,因为骨髓MSCs可以分化为体内多个组织的细胞,可以在全身各处存在并发挥功能,所以这些细胞可作为细胞和基因治疗的靶细胞,对一些血清蛋白缺损引起的疾病和其他的后天疾病,包括骨、软骨和骨髓基质紊乱,甚至肿瘤等有治疗作用[11]。通过导入目的基因,并与MSC的多向分化潜能相结合,可将细胞治疗与基因治疗结合起来,必将为MSC的临床应用开辟广阔的前景。5　存在问题和展望

尽管近年来对骨髓MSCs的研究取得了很大进展,但仍然存在以下问题尚待解决:(1)由于不同实验室对骨髓MSCs研究方向的不同和骨髓MSCs来源以及分离方法等的差异,对骨髓MSCs本身的研究目前还不系统全面,缺少横向联系。(2)目前尚未能建立鉴定MSCs的统一标准,至今还未能筛选到MSCs特异性的标记分子,因此不同实验室的数据之间的可比性差。随着MSCs的临床应用,MSCs的鉴定也变得尤其紧迫。(3)骨髓MSCs培养过程中的异质性,影响了干细胞分离纯化的效果。长期培养发现,MSCs多次传代后,并不能保留其分化能力。对于传代后MSCs分化能力丧失的原因,近来有人认为与端粒酶缺失有关,依据是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓MSCs,即使是早期的MSCs也不能分化为软骨细胞和脂肪细胞[12]。(4)骨髓MSCs向多细胞谱系诱导分化的分子机制研究进展缓慢,基本停留在外源性物质刺激后,导致细胞内基因表达的开启或是关闭等的研究。干细胞生存的微环境中调控其增殖与分化的关键作用因子以及影响MSC向损伤和缺血区域趋1028中国误诊学杂志2006年3月第6卷第6期　ChinJMisdiagn,Mar2006Vol6No.6

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收稿日期:2005-12-08;修回日期:2006-01-09　　责任编辑:刘继烈

化的因子有哪些等等,这些都是亟待研究的重要课题。(5)虽然在实验动物、甚至在人类身上观察到了一些骨髓MSCs可塑性现象,但对于MSCs是否为杂合源性的细胞群体,并含有各种组织的祖细胞仍存有疑问。如果是不同胚层细胞的混合体,那么在移植过程中有可能出现畸胎瘤的复合物。所以要建立一套干细胞可塑性理论,一方面还需进一步重复验证,另一方面,更应建立评价体内/体外成体干细胞可塑性研究令人完全信服的技术体系,才能更好地从事干细胞可塑性研究。

尽管如此,由于MSCs具有多向分化潜能和高增殖特性,取材容易,对机体损伤小,易于基因操作,组织相容性好等优点,被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞,有着广阔的临床应用前景。【参考文献】

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Ⅱ型糖尿病患者心血管疾病危险因素研究进展

王宏(综述),王永志(综述),高云翔(审校)

【主题词】　糖尿病,Ⅱ型/并发症;心血管疾病/病因学

【中图分类号】　R587.2　　　　　【文献标识码】　A　　　　　【文章编号】　1009-6647(2006)06-1028-03　　Ⅱ型糖尿病(DiabetesMellitus,DM)患者有一系列代谢异常,约有80%的糖尿病患者死于心血管疾病(Cardiovasculardisease,CVD),糖尿病患者的一个主要并发症就是加速动脉粥样硬化(Atherogenesis,AS)的发展。常规心血管病危险因素(Conventionalcardiovascularrisk,CVRF)已被大多数临床医生所认可和作为当前诊断标准的项目,但并不能全面解释Ⅱ型糖尿病患者有加速AS的危险。因为目前已有越来越多的证据表明,AS是一个复杂的多种病因和病程的病变,它既可独立产生也可伴随心血管疾病一同发生。脂蛋白浸润并存储于微小动脉中,活性细胞进入动脉壁,内皮细胞功能紊乱,氧化作用加强,局部和全身性的炎症,免疫反应,凝血功能异常和纤维蛋白溶解,这些可能都是导致AS的重要因素。随着对AS这一复杂机

作者单位:北京市第六医院检验科100007制的深入认识,Ⅱ型糖尿病患者心血管疾病危险因素的研究也有了较大进展,现综述如下。1　脂类与脂蛋白

不论是在糖尿病患者或非糖尿病患者中,血脂紊乱都是被广为接受的与动脉粥样硬化相关的危险因素,在Ⅱ型糖尿病中有一个特征性的脂类谱:高甘油三酯,正常或增高的低密度脂蛋白,高密度脂蛋白减低[1]。

可致AS的潜在的脂蛋白包括血浆中高甘油三酯水平,低密度脂蛋白(LDL)水平升高和高密度脂蛋白(HDL)减少,而这正是典型的Ⅱ型糖尿病型脂蛋白血症。然而另一些观点也值得我们进一步探讨,脂蛋白残基可继续进行酶的催化和氧化,产生大量感染原颗粒。在Ⅱ型糖尿病中,脂蛋白潴留增加,其出现与高血糖程度和胶原表面糖基与脂蛋白的结合能力相关的。然