缺血-再灌注损伤

缺血-再灌注损伤

(ischemia-reperfusion injury)

第一节 概述

病例：患者，男，54岁，因胸闷、大汗1h入急诊病房。体查：血压65/40mmHg，意识淡漠，心率37次/min，律齐。既往有高血压病史10年，否认冠心病史。心电图示Ⅲ度房室传导阻滞。给予阿托品、多巴胺、低分子右旋糖酐等进行扩冠治疗。入院上午10时用尿激酶静脉溶栓。10时40分出现阵发性心室颤动（室颤），立即给予除颤，至11时20分反复发生室性心动过速、室颤，共除颤7次，同时给予利多卡因、小剂量异丙肾上腺素后心律转为窦性，血压平稳，意识清楚。冠状动脉造影证实：右冠状动脉上段85%狭窄，中段78%狭窄。 结合以上心肌梗塞的病例提问“为什么在溶栓后出现严重的心律失常?”，从而引出“缺血后再灌注可能造成更为严重的损伤”。

一、缺血-再灌注损伤的研究简史和现状

早在1955年Sewell报道，在结扎狗冠状动脉后，如突然解除结扎，恢复血流，部分动物立即发生心室纤颤而死亡。1960年，Jennings第一次提出心肌缺血-再灌注损伤的概念，即在心肌缺血恢复血流后，缺血心肌的损伤反而加重。1967年，Bulkley 和Hutchins发现冠脉搭桥血管再通后的病人发生心肌细胞反常性坏死。此后发现几乎所有的器官都可能发生缺血再灌注损伤。在临床中，休克时微循环的疏通、冠状动脉痉挛的缓解、心脑血管栓塞再通（经皮腔内冠脉血管成形术-PTCA)、心肺手术体外循环后和心脏骤停后心肺脑复苏、断肢再植、器官移植血供恢复等都可能发生再灌注损伤。在20世纪80年代，缺血-再灌注损伤发生机制的研究是一个热点，我室是全国首先开展缺血-再灌注损伤研究的单位之一。直到现在心肌缺血-再灌注损伤仍是我室的研究方向之一。

二、缺血-再灌注损伤的定义

缺血的组织、器官经恢复血液灌注后不但不能使其功能和结构恢复，反而加重其功能障碍和结构损伤的现象称为缺血-再灌注损伤。缺血-再灌注损伤不等于缺血-再灌注，后者是治疗缺血性疾病的主要措施之一。缺血后再灌注，绝大部分缺血的组织器官功能和结构可以恢复，只有少部分情况下会发生缺血-再灌注损伤，缺血-再灌注损伤并不是不可逆的。

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第二节 原因和条件

一、原因

缺血-再灌注损伤发生的前提是缺血，所以凡能引起组织器官缺血的因素都可能成为缺血-再灌注损伤的原因。

二、条件

（一）缺血的时间和程度：再灌注前组织缺血时间长短和再灌注损伤的发生关系密切，缺血时间过短或过长均不易发生再灌注损伤。

（二）组织缺血前的状态：一般而言，侧枝循环丰富的组织不易发生缺血再灌注损伤，对氧需求较高的组织易发生再灌注损伤，如心脏和大脑。

（三）再灌注条件：一定程度的低温、低压、低pH、低钠、低钙灌流液灌注，可减轻再灌注损伤，而高钠、高钙可诱发再灌注损伤。

第三节 发病机制

缺血-再灌注损伤是一种反常现象，它的发生与活性氧大量产生、细胞内钙超载、中性粒细胞活化和高能磷酸化合物生成障碍等有关。 一、活性氧的作用

（一）活性氧和自由基的概念和种类 1. 活性氧（reactive oxygen）

活性氧是指化学性质活泼的含氧代谢物，包括氧自由基、单线态氧（1O2）、H2O2、NO、脂性过氧化物（LOOH）及其裂解产物LO•、LOO•等。 2. 自由基（free radical）

自由基是指外层轨道上含有单个不配对电子的各种原子、原子团或分子。特点：化学性质活泼、氧化性强、半衰期短。自由基按不配对电子所在的原子来分类，分为氧自由基、脂性自由基和氮中心自由基。

(1) 氧自由基 (oxygen free radical)：以氧为中心的自由基称为氧自由基，即不配对电子位于氧原子上。如：超氧阴离子自由基、羟自由基(OH• )。注意区分活性氧和氧自由基，强调H2O2是活性氧而不是氧自由基。氧自由基主要是在线粒体中产生，1-2%的氧通过单电子还原产生超氧阴离子自由基、H2O2

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和OH•。超氧阴离子通过超氧化物歧化酶催化生成H2O2。超氧阴离子和H2O2反应生成OH•，该反应如果没有铁离子的参与，反应速度慢，称为Haber-Weiss反应；如果有铁离子的参与，反应速度大大增加，称为Fenton 型Haber-Weiss反应。

图7-1 线粒体单电子还原生成活性氧

图7-2 Fenton 型Haber-Weiss反应

(2) 脂性自由基指氧自由基与多不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物，包括烷自由基（L•）、烷氧自由（LO•）、烷过氧自由基（LOO•）等。 (3) 氮中心自由基: 包括一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。NO是一个气体分子，硝酸甘油等硝酸脂类药物通过代谢生成NO从而发挥扩血管的作用，这一发现获得了1998年诺贝尔生理医学奖。在本章中，NO作为自由基可以在机体的免疫系统抵御病毒等病原体的入侵。在单核-巨噬细胞中，NO通过诱导性一氧化氮合酶（iNOS）产生，继而NO与超氧阴离子发生反应生成

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ONOO，后者具有强氧化性，能够杀死病原体（强调ONOO不是自由基）。

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图7-3 NO 和ONOO-的生成

3. 单线态氧（singlet oxygen）

单线态氧（1O2）是一种激发态氧，其氧分子两个外层轨道中的一个电子发生反向自旋改变，使外层轨道两电子自旋方向相反，氧分子的反应能力大大增加。这种氧分子在紫外光谱中呈现一条单线，故称为单线态氧。如图所示，正常的氧属于三线态氧，外层轨道上有两个自旋方向相同的未配对电子；如果受到激发，这两个电子的自旋方向变成相反，形成两种类型的单线态氧。D型单线态氧外层轨道上没有未配对电子，不是氧自由基，但属于活性氧，S型单线态氧外层轨道上有未配对电子，是氧自由基。

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图7-4 单线态氧的电子排布及相对能量

（二）活性氧的清除 1. 酶性清除剂

SOD：超氧化物岐化酶有Mn-SOD 和Cu,Zn-SOD两种形式，清除超氧阴离子（结合霍金的故事讲述Cu,Zn-SOD基因突变导致家族性脊髓侧索硬化症）。 CAT和过氧化物酶：清除H2O2

2. 非酶性抗氧化物：如维生素E、维生素A、维生素C、半胱氨酸、谷胱甘肽、白蛋白、铜蓝蛋白等可清除活性氧或控制活性氧的生成。列举生活中用维生素E、维生素A、维生素C等抗衰老的例子。

由于机体存在以上抗氧化防御体统，体内活性氧的产生和清除处于动态平衡。

（三）缺血-再灌注时活性氧增多的机制 1. 线粒体内单电子还原生成氧自由基增加

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图7-5 缺血-再灌注时线粒体产生活性氧示意图

组织细胞缺血缺氧使呼吸链传递电子的效能下降，而且缺氧使电子受体减少，所以缺血区活性氧的产生并不增加。再灌注时提供大量的氧，而线粒体呼吸链上的酶活性却不能迅速增强，致使氧经单电子还原成氧自由基增多。此外，Ca2+超载使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统被抑制，也会使活性氧的产生增多。

2. 血管内皮细胞内黄嘌呤氧化酶形成增加

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图7-6 缺血-再灌注时黄嘌呤氧化酶在活性氧生成中的作用

组织缺血时，细胞内Ca2+增多，激活Ca2+依赖性蛋白酶，使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶，使黄嘌呤氧化酶大量增加；同时，由于ATP降解，次黄嘌呤生成增加。再灌注提供了大量的氧，使缺血时积聚的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成黄嘌呤，后者再在黄嘌呤氧化酶作用下生成尿酸，这两个过程都有活性氧生成。

3．白细胞呼吸爆发产生大量活性氧

白细胞吞噬时伴耗氧量显著增加的现象，称呼吸爆发(respiratory burst)。

图7-7 白细胞呼吸爆发产生大量活性氧

4. 儿茶酚胺的自身氧化： 缺血缺氧时交感-肾上腺髓质系统会释放和分泌大量儿茶酚胺，后者在单胺氧化酶的作用下，自氧化生成氧自由基。 5. 体内清除活性氧的能力下降：缺氧导致的细胞中抗氧化酶活性降低，氧自由基清除减少，也是氧自由基增多的原因之一。 （四）活性氧的损伤作用

活性氧可以和膜磷脂、蛋白质、核酸等多种细胞成分发生反应，破坏

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细胞的结构和功能，造成细胞损伤。

图7-8 活性氧使脂质、蛋白质、核酸氧化

1. 膜脂质过氧化（ lipid peroxidation）

生物膜（细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜和内质网膜）是活性氧攻击的主要部位。生物膜的主要成分是极性脂质（磷脂、胆固醇）和膜蛋白（酶、受体、离子通道等）。膜磷脂富含多价不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化。

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图7-9 膜脂质发生过氧化

（1）细胞膜结构破坏：质膜脂质过氧化使细胞膜不饱和性改变，继之发生膜流动性降低、脆性增加、受体失活、离子通道变构、酶活性改变，从而引起细胞功能和结构变化。

图7-10活性氧对膜的损伤作用

（2）细胞器膜结构破坏：①溶酶体破裂释放溶酶体酶，引起细胞结构损坏；②线粒体肿胀、功能障碍，产能减少；③肌浆网Ca2+-ATP酶活性降低使摄取的Ca2+减少，导致细胞内钙超负荷。

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（3）脂质信号分子生成异常：

图7-11 肌醇磷脂在细胞信号转导中的作用

肌醇磷脂PI的脂质过氧化会使前列腺素（PGs）、1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）等生成障碍，导致细胞信号转导异常。 2. 蛋白质失活

活性氧对酶活性的影响包括：①破坏氧化酶的活性中心－巯基；②破坏酶活性所必须的脂质微环境；③在酶蛋白之间发生交联形成多聚物；④攻击酶活性中心部位的氨基酸；⑤激活磷脂酶A2使膜磷脂释放出花生四烯酸，导致前列腺素、白三烯生成增多，炎症反应加剧。 3. DNA损伤

活性氧可以与核酸反应从而使碱基发生修饰、断裂和交联。造成DNA损伤的活性氧是•OH（占80%）和NO。 4. 细胞间基质破坏

氧自由基可使透明质酸酶降解、胶原蛋白交联，从而使细胞间基质变得疏松、弹性降低。

二、钙超载

(一)细胞内Ca2+的稳态调节（要理解钙超载的机制，必须了解正常细胞钙的稳态调节）

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图7-12 正常细胞钙的稳态调节

1.Ca2+进入胞液的途径

(1) 质膜钙通道：质膜钙通道主要有二类，一类是电压依赖性Ca2+通道（voltage operated calcium channels，VOC），当膜电位达一定程度时开放，使细胞外的Ca2+进入细胞内。另一类是受体操纵性Ca2+通道（receptor operated calcium channels，ROC ）,又称配体门控Ca2+通道。当与激动剂结合后开放，使细胞外的Ca进入细胞内。

(2) 细胞内钙库释放通道：细胞内游离Ca2+主要储存于内质网/肌浆网中，通过IP3敏感和不敏感的通道释放到胞浆中。 2. Ca2+离开胞液的途径

(1) Ca2+泵的作用：Ca2+泵即Ca2+- ATP酶，其活性依赖Ca2+和Mg2+，存在于细胞膜、内质网膜和线粒体膜上。当[Ca2+]升高到一定浓度时，Ca2+泵被激活，将Ca2+逆浓度梯度泵出细胞或泵入细胞器，降低细胞内Ca2+浓度。 (2) Na+-Ca2+交换：Na+-Ca2+交换载体是一种非耗能的转运方式，转运方向为双向性。生理情况下，细胞外Na浓度高于细胞内，Na通过Na-Ca交换载体顺电化学梯度进入细胞，Ca2+逆电化学梯度移出细胞，一般是3个Na+交换1个Ca2+ 。

（二）细胞内钙超载的产生机制

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1966年Zimmerman和Hulsmann发现，用无Ca的“生理盐溶液”灌注大鼠离体心脏，短时间内即发生肌膜损伤，随后灌注正常含钙的生理溶液，心脏发生更为严重的结构和功能改变，这称为钙反常，这种现象与细胞内的钙离子增多即钙超载有关。各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象，称为钙超载（calcium overload）。1986年Young证实脑缺血再灌注后也存在钙超载。 缺血再灌注引起钙超载的机制：

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图7-13 缺血-再灌注损伤时钙超载的机制

1. 细胞膜通透性增加

缺血造成细胞膜外板与糖被分离，使细胞膜对钙的通透性大大增加；细胞内Ca2+增加又可激活磷脂酶，使膜磷脂降解，细胞膜通透性进一步增高。当再灌注时，钙离子顺细胞内外的浓度差大量进入细胞内。

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2. Na-Ca交换异常

缺血缺氧时，细胞内pH降低（细胞内酸中毒），恢复灌注使细胞内外形成pH梯度差，Na+-H+交换增强，使细胞内Na+增加，从而使Na+-Ca2+交换发生反向转运，细胞外Ca2+大量内流，造成细胞内钙超载。 3. 儿茶酚胺增多

缺血再灌注时儿茶酚胺大量产生，通过α受体激活磷脂酶C，产生三磷酸肌醇（IP3），导致内质网/肌浆网上钙通道开放，使细胞内钙库释放钙。 4. 活性氧产生增加

缺血再灌注时大量产生的活性氧可以破坏细胞膜，造成膜通透性增加从而使钙内流增加。活性氧还可以损伤线粒体膜，导致ATP生成减少，抑制钙泵活性；损伤肌浆网和内质网，影响钙的转运，加剧细胞内钙超载。细胞内钙增多为什么会造成细胞损伤？

（三）钙超载引起细胞损伤的机制 1. 线粒体功能障碍

胞浆内高浓度的Ca2+使线粒体摄取Ca2+增加， Ca2+浓度增高使线粒体内形成磷酸钙沉积，影响ATP合成，导致ATP合成减少。 2. 激活钙依赖性降解酶

Ca2+浓度增高可激活多种钙依赖性降解酶。磷脂酶激活促进膜磷脂水解，造成细胞膜及细胞器质膜受损；蛋白酶和核酸内切酶激活可引起细胞骨架和核酸分解，导致细胞损伤。 3. 促进活性氧生成

在自由基学说中已讲述钙超载激活Ca2+依赖性蛋白酶，促使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，致使活性氧生成增加，损害组织细胞。此外，钙超载还可激活磷脂酶A 2，通过环加氧酶和脂加氧酶，在花生四烯酸形成过程中产生H2O2和•OH。

4. 破坏细胞骨架

三、白细胞的作用

许多研究证实，组织缺血早期即可见大量白细胞浸润，再灌注时白细胞聚集进一步增加。在缺血和再灌注时白细胞为什么聚集呢？ (一) 白细胞聚集的机制

以下列图示讲述白细胞聚集的机制

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图7-14 缺血-再灌注时白细胞的聚集

正常情况下，微血管内皮细胞仅表达少量黏附分子（黏附分子是指由细胞合成的，并可促进细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间黏附的一类分子的总称，如整合素、选择素、细胞间粘附分子、血管细胞黏附分子及血小板内皮细胞黏附分子等），故血管内皮细胞和血液中流动的中性粒细胞互相排斥保证血流通畅。缺血-再灌注后数分钟内，血管内皮细胞和白细胞表达大量黏附分子，如P-选择素表达增加，使白细胞沿内皮细胞表面缓慢滚动，形成不稳定黏附。再灌注4h后，整合素表达增加，白细胞和内皮细胞出现牢固黏附。同时，再灌注损伤时，内皮细胞和白细胞释放具有趋化作用的炎症介质如LTB4，这些趋化因子吸引大量白细胞穿过血管壁游走到细胞间隙，从而导致白细胞黏附聚集。白细胞聚集对局部的组织会造成什么样的后果？ （二）白细胞聚集在缺血-再灌注损伤中的作用 1. 阻塞微循环

以无复流现象阐明白细胞黏附聚集对缺血-再灌注组织微循环的影响。恢复血液灌注后，缺血区依然得不到充分血流灌注的现象称无复流现象。 2. 释放活性氧

在自由基学说中，白细胞呼吸爆发会释放超氧阴离子、过氧化氢、次氯酸等活性氧。

3. 释放各种颗粒成分

白细胞活化后将释放许多颗粒成分，包括酶性成分和非酶性成分。

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4. 产生各种细胞因子

四、高能磷酸化合物生成障碍

缺血缺氧时ATP合成显著减少，而有实验证明，心脏再灌注20min后ATP仅为正常值的一半，再灌注24h仍维持在低水平。为什么再灌注后高能磷酸化合物生成仍存在障碍？

1．线粒体受损：再灌注时，活性氧和钙超载使线粒体损伤，受损线粒体对氧利用能力下降，合成ATP 能力下降。

图7-15 线粒体的结构

2．ATP合成的前身物质减少 ：ATP合成的前身物质（如腺苷、肌苷、次黄嘌呤等）在再灌注时被冲洗出去，使缺血区组织失去再合成高能磷酸化合物的底物。

小结缺血-再灌注损伤的机制。指出缺血-再灌注损伤的发生与上述原因均密不可分，活性氧的产生过多和细胞内钙超载互为因果关系。请同学们思考活性氧的产生增多和细胞内钙超载如何互为因果关系？

第四节 机体主要器官的缺血-再灌注损伤

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缺血-再灌注损伤在所有的器官均可发生，心脏和大脑是对氧需求比较高的器官，因此两者更容易发生缺血-再灌注损伤。 一、 心脏缺血-再灌注损伤

心脏缺血-再灌注损伤研究得比较深入，其主要功能、代谢变化包括： 1. 缺血-再灌注性心律失常

心肌缺血-再灌注过程中心律失常发生率较高，多为室性心动过速和心室颤动。自由基和钙超载造成的心肌损伤及ATP减少使ATP敏感性钾通道激活是缺血-再灌注性心律失常发生的主要原因。

2. 心肌舒缩功能下降

心肌舒缩功能下降表现为心肌顿抑（myocardial stunning），后者是指心肌经短暂缺血并恢复供血后，在一段较长时间内处于“低功能状态”，常需数小时或数天才可恢复正常功能的现象。心肌顿抑是心肌缺血-再灌注损伤的表现形式之一。心肌顿抑的产生与活性氧生成、钙超载、白细胞活化、合成高能磷酸化合物能力降低以及微血管灌注障碍有关。

3.心肌结构的变化：表现为心肌细胞水肿、心内膜下出血或出血性梗死。

列表比较心肌缺血损伤和再灌注损伤

二、脑缺血-再灌注损伤

1. 临床表现：感觉、运动或意识严重障碍

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2. 脑电图：病理性慢波 3. 组织学变化：脑水肿 发生机制的特点：

1. 兴奋性氨基酸的神经毒性作用 2. 脑细胞更易受活性氧损伤

第五节 防治的病理生理学基础

一、尽早恢复血流，减少缺血时间：这是防治缺血-再灌注损伤的基本原则。

二、采用低压、低温、低流、低钙再灌注液

请同学们结合缺血-再灌注损伤的发生机制思考为什么采用低压、低温、低流、低钙液进行灌注可能减轻缺血-再灌注损伤？ 三、清除活性氧

四、钙拮抗剂的使用

五、抗白细胞疗法

六、补充能量及促进能量生成

七、启动细胞内源性保护机制（结合本室的研究简单介绍缺血预适应的概念和特点）

小 结

缺血-再灌注损伤是指组织、器官缺血后再灌注不但不能使其功能恢复，反而加重组织、器官的功能障碍和结构损伤的现象。缺血-再灌注损伤的发生机制与活性氧产生增多、细胞内钙超载、中性粒细胞活化聚集和高能磷酸化合物生成障碍等有关。心脏缺血-再灌注损伤主要表现为再灌注性心率失常和心肌顿抑。缺血-再灌注损伤的防治应从清除和减少活性氧产生、降低细胞内钙水平和抗白细胞疗法等入手。

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复习思考题

1．试述线粒体在缺血-再灌注损伤发生中的作用。

2．为什么说氧自由基产生过多和细胞内钙超载互为因果关系？

3．试述缺血-再灌注时通过黄嘌呤氧化酶途径引起氧自由基增多的机制。

5．试分析白细胞在发生缺血-再灌注损伤中的作用。 6. 心肌缺血损伤和再灌注损伤的表现有何不同？ 7. 为什么脑细胞更易受活性氧损伤？

8. 试述缺血-再灌注区ATP生成能力下降的机制。

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