RT_PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

.21,VolNo.32001

　　　May

RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

李　军1,林继煌1,陆承平2,何孔旺1,倪艳秀1,还红华1,钱永清3　(11江苏省农业科学院

　农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室,江苏南京210014;21南京农业大学动物医学院,江苏　南京210095;31上海农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)

端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增摘要:根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白S基因的5′

的目的片段长度为886bp。在优化RT2PCR反应条件的基础上,建立了检测TGEV的RT2PCR方法。用此

RT2PCR方法检测56份猪腹泻粪样,同时用夹心ELISA法作对照。结果显示,RT2PCR法检测的20份阳性

粪样,用夹心ELISA法检测有14份呈阳性,两者的符合率为89%。RT2PCR法比夹心ELISA法敏感性更高,可用于TGEV的诊断和流行病学调查。

关键词:传染性胃肠炎病毒;RT2PCR;夹心ELISA

中图分类号:S852165　　　文献标识码:A　　　文章编号:100524545(2001)0320246203　　猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断方法目前主要有中和试验(NT)、免疫荧光技术(IF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。这些方法最主要的缺陷是难以检出微量病毒,不适宜早期诊断。1997年,Woods

及猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)细胞毒,处理方法同上。以上皆为江苏省农科院牧医所保存之毒株。113　RT-PCR

11311　引物　按文献[2]选取TGEVS基因5′

和Paton等[2]应用RT2PCR技术检测

敏感的TGEV,结果证实RT2PCR是一种特异、

TGEV诊断方法。但国内迄今未见有类似报道。本试验旨在建立TGEV的RT2PCR检测方法,为该病的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段。

[1]

端的2段高度保守的序列作为引物。

上游引物(P1):5′2TATTTGTGGTTTTGGTTATAATGC23′下游引物(P2):5′2GGCTGTTTGGTAACTAATTTGCCA23′

1　材料与方法

111　粪便标本的收集与处理　仔猪腹泻粪便标

其中P1与TGEVS基因的11～34位核苷酸相同,P2与TGEVS基因的896～873位核苷酸互补。引物扩增长度为886bp。

引物由美国生命技术公司上海办事处合成,用TE缓冲液将其稀释成50Λmol󰃗L,-20℃冻存备用。

11312　试剂　AMV逆转录酶、TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等,均为美国Promega公司产品。MgCl2、PCRMarkers,购自上海华美公司。

11313　RNA的提取　采用异硫氰酸胍法。在115mLEP管中,加入病毒液200ΛL,充分摇动。

本,收集自安徽和江苏,共56份。用PBS稀释成10%～20%的悬液,5000r󰃗min离心10min,取

上清置-20℃冻存备用。

112　参考毒株　TGEV组织毒悬液,处理方法

同111。TGEV细胞毒,将PK15细胞培养液冻融3次,5000r󰃗min离心10min,取上清置-20℃冻

存备用。猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞毒、猪轮状病毒(PRV)细胞毒、牛轮状病毒(BRV)细胞毒

　　收稿日期:2000206203

　　作者简介:李军(1975～),男,硕士。

加入40Λ加入酚∶氯仿∶异戊醇L乙酸钠,混合。440ΛL,用力振荡10s,冰上冷10min。4℃12000r󰃗min离心15min。小心吸取上层含有

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第3期李　军等:RT2PCR检测猪传染性胃肠炎病毒247

RNA的水相。加等体积异丙醇,-20℃至少作用30min以沉淀RNA。4℃12000r󰃗min离心15min。弃上清,加变性液200ΛL重悬RNA沉淀

显色液,TMB2H2O2;终止液,1mol󰃗LH2SO4;酶

标板,40孔聚苯乙烯微孔板。

11712　方法　按照文献[3]稍加改进。用酶联仪

物,涡旋振荡直至RNA完全溶解。加等体积异丙醇,-20℃至少作用30min。4℃12000r󰃗min离心15min。弃上清,70%乙醇洗涤RNA沉淀,如悬浮则10000r󰃗min离心10min。弃上清,干燥30min。加入10ΛL无RNA酶纯水重悬RNA沉

测定D450nm,以P󰃗N≥210判为阳性。每次试验均

设阳性对照、阴性对照和空白对照。

2　结果

211　RT-PCR　经过试验比较,在本试验条件

淀。UV2754C紫外可见分光光度计上测D260,计

算RNA含量。

11314　逆转录　在015mLEP管中依次加入5×RTBuffer410ΛL,10mmol󰃗LdNTPs210ΛL,50Λmol󰃗L下游引物P2110ΛL,32U󰃗ΛLRNA酶抑制剂015ΛL,双蒸水115ΛL,模板RNA1010ΛL,总体积为1910ΛL。95℃5min后,立即冰浴5min,使模板充分变性,然后加入AMV逆转录酶1ΛL,使总体积为20ΛL。42℃水浴1h后,95℃5min灭活AMV逆转录酶。11315　PCR　在015mLEP管中依次加入10×PCRBuffer215ΛL,MgCl2XΛL,215mmol󰃗LdNTPs115ΛL,50Λmol󰃗L上游引物P1110ΛL,50Λmol󰃗L下游引物P2110ΛL,cDNA310ΛL,3U󰃗ΛLTaqDNA聚合酶015ΛL,双蒸水1515-X

下,最佳Mg2+浓度为110mmol󰃗L,即在25ΛL

PCR反应体积中,加25mmol󰃗LMgCl21ΛL。经过反应条件的优化,最后确定的PCR模式为:93℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环后,72℃延伸5min。

212　RT-PCR特异性试验　对TGEV细胞毒和

组织毒进行RT2PCR,都能扩增出886bp的目的条带。同时对正常PK15细胞和PEDV、PRRSV、PRV、BRV进行RT2PCR,未扩增出任何条带(见图1)。

ΛL,总体积为2510ΛL。覆盖25ΛL液体石蜡油后,用PCR扩增仪进行三温循环。

11316　PCR反应条件的优化　以从TGEV细胞培养物提取的核酸为标准,对PCR的各循环参数(Mg2+浓度、变性温度、退火温度、延伸温度)、循环次数进行优化,以确定PCR的最优模式。114　RT-PCR产物的检测　采用常规的琼脂糖凝胶电泳法,胶浓度为112%。

115　RT-PCR特异性试验　取TGEV细胞毒和组织毒及正常PK15细胞、PEDV、PRRSV、PRV、BRV,按上述方法进行RT2PCR。

116　RT-PCR敏感性试验　将从TGEV中提取

图1　RT2PCR的特异性　M.Marker;11TGEV细胞

毒;21TGEV组织毒;31正常PK15细胞;41PEDV;

51PRRSV;61PRV;71BRV

213　RT-PCR敏感性试验　试验结果表明,RT2PCR可检出1pg的TGEVRNA(见图2)。

的ssRNA定量,从1ng起连续10倍稀释至1pg,按上述方法进行RT2PCR。117　夹心ELISA

11711　试剂及材料　兔抗猪传染性胃肠炎病毒IgG(RTGEVIgG),自制,工作浓度为1∶1200;HRP标记RTGEV(HRP2RTGEV),自制,工作

图2　RT2PCR的敏感性　M.Marker;111ng;21100

pg;3110pg;411pg

浓度为1∶1500;包被液,0105mol󰃗LpH916碳酸盐缓冲液;稀释液和洗涤液,pH714磷酸盐缓冲液(含0105%吐温20);封闭液,10%犊牛血清;

214　RT-PCR对粪便样品的检出结果　56份粪

样中共检出20份阳性粪样,36份阴性粪样,TGEV的阳性粪样检出率为3517%。

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248中　　国　　兽　　医　　学　　报2001年

215　粪样夹心ELISA法检测结果　在56份粪

样中,共检出14份阳性,42份阴性,阳性粪样检出率为25%。

216　RT-PCR与夹心ELISA检测结果比较　夹心ELISA检出的14份阳性粪样,RT2PCR也呈阳性。有6份粪样RT2PCR检测为阳性,而用夹心ELISA检测为阴性(见表1)。两者的符合率为:(P1+P2)󰃗56=89%。表明P3=(14+36)󰃗RT2PCR与夹心ELISA的特异性一致,但前者比

毒,且敏感度可达pg水平。此外,本实验室已建立

了检测轮状病毒(RV)的RT2PCR方法[4]。目前正在探索适合于PEDV的引物,以便将TGEV、PEDV及RV的引物合在一起,建立用于3种猪病毒性腹泻病毒鉴别诊断的三重PCR方法。参考文献:

[1]　WoodsRD.DevelopmentofPCR2basedtechniques

toidentifyporcinetransmissiblegastroenteritiscoronavirusisolates[J].CanJVetRes,1997,61(3):167～172.

[2]　PatonD,IbataG,SandsJ,etal.Detectionoftrans2

missiblegastroenteritisvirusbyRT2PCRanddif2ferentiationfromporcinerespiratorycoronavirus[J].JVirolMethods,1997,66(2):303～309.[3]　BernardS,LantierI,LantierI,etal.Detectionof

transmissiblegastroenteritiscoronavirusantigensbyasandwichenzyme2linkedimmunosorbentassey

后者更敏感。

表1　RT2PCR及夹心ELISA检测结果

RT2PCR+

-036

+-146

夹心ELISA

3　讨论

　　RT2PCR用于TGEV的检测在国外已有先

例,但国内目前尚未见报道。本试验通过PCR反应条件的优化,成功地建立了检测TGEV的RT2PCR方法,可有效地检测TGEV细胞毒和粪便

technique[J].AmJVetRes,1986,47:2441～2444.

[4]　倪艳秀,林继煌,陆承平,等1逆转录2聚合酶链反应

(RT2PCR)检测轮状病毒[J].中国兽医学报,1998,18(5):437～440.

DetectionofTransmissibleGastroenteritisVirus(TGEV)byRe-verseTranscription-PolymeraseChainReaction

112111

LIJun,LINJi2huang,LUCheng2ping,HEKong2wang,NIYan2xiu,HUANHong2hua,

3

QIANYong2qin(1.KeyLaboratoryofAnimal&PoultryDiseasesDiagnostic,Ministryof

　Agriculture,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China;2.College　ofAnimalMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210014,China;3.Institute　ofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShanghaiAcademyofAgricultural　Sciences,Shanghai201106,China)

　　Abstract:ApairofoligonucleotideprimersappropriateforPCRamplicationwereselectedbasedonthetwoconservedregionsofthe5′endofthegeneencodingtheSproteinofTGEV.Areversetranscription2polymerasechainreaction(RT2PCR)assaywasdevelopedforthedetectionofTGEVaf2

.ThesandwichELISAwasalsousedforcontrol.Outof56teroptimizationofthereactionconditions

fecalsamples,20werepositivedetectedbyRT2PCR,meanwhileonly14werepositivedetectedbysandwichELISA.Thecorrespondingrateofthetwomethodswas89%.ItsuggeststhatRT2PCRismoresensitivethansandwichELISAandshouldbequiteusefulfordetectionofTGEVandtheepi2demiologicalsurveyofTGE.

　　Keywords:TGEV;RT2PCR;sandwichELISA

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