丝状真菌基因组DNA的提取

1. 打开ClustalX软件（对序列进行比对），点击“文件”→“载入序列”；点击“比对” →“输出格式选项” →“phylip格式”前打勾；点击“比对” →“完全比对”；比对完成后，关闭程序，并将生成的带.phy后缀的文件拷贝至phylip软件包的“exe”文件夹下。

2. 打开seqboot软件，按照路径输入所拷贝的“.phy”文件，回车

3. 输入“r”，回车→输入1000，回车→输入“y”，回车→输入“5”，回车→出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序，完成seqboot（上图中的J选项代表评估方法，默认为bootstrap法进行评估，可更改选项；R选项默认多少次，输入1000表示共进行1000次的republicate）。自动生成文件“outfile”，可用记事本打开。

4. 将刚刚生成的outfile文件更名为infile1，打开dnadist软件（采用邻位相连算法构建进化树，如采用其他算法，则用其他软件），按照路径输入文件名infile1，回车

5. 输入t，回车→输入20，回车→输入m，回车→输入d，回车→输入1000，回车→输入y，回车→等待……等待……等待……时间长度视序列多寡长短及重复数多寡而不等，直到出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序（D选项为距离模式，默认为F84；T选项为点突变的“转换/颠换比率”，通常在15～30之间；M选项采用和原来一样的重复数；输入d，采用data sets）。自动生成文件outfile。

6. 将outfile重命名为infile2，打开neighnor软件（采用邻位算法），按照路径输入infile2，回车

7. 输入选项m，回车→输入1000，回车→输入奇数5，回车→输入y，回车→等待……

一定时间后出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序。生成两个文件outfile和outtree。Outfile是分析结果的输出报告，可用记事本打开，outtree可用treeview打开。

8. 将outfile更名为outfile1，outtree文件更名为intree1，打开consense软件，按照路径输入intree1，回车

9. 输入y，回车→等待……一定时间后出现“press enter to quit”字样时，回车，退出程序。生成两个新文件outfile和outtree。Outtree就是最终结果，可用treeview软件打开观看

丝状真菌基因组DNA的提取（CTAB法）

— 取幼嫩的菌丝体，用液氮研成粉末，每 0.8 g 装入 10 mL 的离心管中；

— 预热 1.5×CTAB 到 95 ℃，加 2 mL 到装有菌丝粉末的离心管中，混匀；

— 立即置于 65 ℃ 水浴 30 min，每分钟，上下颠倒 1 次；

— 12000 g 离心 5 分钟；

— 吸取上清液，加等体积的氯仿，上下颠倒数次；12000 g 离心 5 分钟；

— 吸取上清液，加等体积的酚，上下颠倒数次；12000 g 离心 5 分钟；

— 吸取上清液，加等体积的氯仿，上下颠倒数次；12000 g 离心 5 分钟；

— 取上清，加入 2 倍体积的无水乙醇和 1/10 体积的 10 M NH4Ac，混匀，室温放置 10 min；

— 12000 g 离心 10 分钟，去上清，用 75% 乙醇洗沉淀，自然干燥；

— 加 100uL 的 TE 或无菌水。

楼主，我也是做真菌转化的，有好的东西一起分享哈O(∩_∩)O~

中文有很多呀，微生物学报，菌物学报，微生物通报等！

英文的有：Mycotaxon（0.5左右）、studies in mycology（9.03左右）

详见如下：

http://essaystar.com/sci2010/smallclass/真菌学.html

ITS区域，内转录区间，是一段比较保守的区域，长度一般为700~800bp。一般PCR得到的ITS区域，测得序列在NCBI上BLAST后一般可以确定到属一级，但是一般应辅助以形态学鉴定才较为可靠。

用不用载体 取决于你的实验室 得到纯化后的真菌遗传指针信息 然后送交测序公司即可(但是像上海生工这样的公司 会要求你的DNA 的浓度为OD260/OD280到1.8至2.0 而且要你提供引物 如果是经典的比如18S等的 则不要 否则经常会测不出信号 如果实验室钱多 那就送到TaKaRa 日本人的服务很全面 而且质量可靠 但是价钱奇贵) 如果你们实验室做载体连接比较多 那就连个载体 再送出去测序 同样也要提供引物 但这样的

话 可能会便宜一点 但是这样就将测序的一部分风险转嫁到你自己的因素上了 所以 这完全取决于你的选择了 祝你好运

不用连接，让测序公司电泳回收，直接把PCR产物送测，省时省力省钱，四天后能得到结果。

这样的帖子这几天有三张，加上以前的就更多了，楼主发帖之前先站内搜索一下就明白了，省力得多。不过楼主是昨天才加入的新人，以后会学会这招的。

因为PCR可能有非特异性扩增，造成除了目的条带之外还有干扰条带产生，他们都是用同一对引物扩增得来的，所以在测定序列的时候会在同一个碱基的位置上出现两个碱基反应同等强度，不知道正确的序列中应该是其中的哪一个，所以为了保证产物纯度，最保险的方法就是将PCR产物跑电泳，回收预计大小的条带。我以前是在有杂带时就会回收才送测，现在是写明目的条带在哪里，直接将PCR产物送测，让他们回收。花费是稍微多一点，但我的样品有二十几个，一个人回收要很久，公司人多，这样我得到结果就快得多。

问一下，我想构建16s rRNA基因文库。DNA提取、PCR扩增（引物27f，1492r，产生片段约1500bp）纯化都没有问题，连接载体pMDT19，连接后转化、涂布平板有单克隆出来，但做菌落PCR时最多只有200bp的结果出来，是什么原因呢？

构建另外一个目的基因克隆文库，同样的操作步骤，只是另外一对引物扩增出的是500bp产物，克隆后菌落pcr能够成功。

我们实验室自行筛选了一株纤维素产生菌，经过高静水压诱变后得到了一株纤维素产量极高的突变株（纤维素产量是出发株的3倍多，也是目前资料报道中最高产的）。我把突

变株的形态学、生理生化指标和系统发育都做了，根据结果对菌株做了分类鉴定。应老师要求，我将材料整理出来写成文章，没想到投了许多期刊，都以“研究内容不在本刊收录范围，建议另投他刊”。很郁闷哪！我是第一次投SCI，没有投稿经验，导师不懂微生物，更没有投稿经验。在这里，求助各位高人给予指点，这类菌种描述和分类的文章该投哪些期刊？

Fungal Diversity

http://www.fungaldiversity.org/fdp/fdp.htm

International Journal of Systematic Bacteriology

分形态学鉴定和分子鉴定

一般二者结合起来

形态学一般都会参考一些资料，具体的图片描述什么的

分子鉴定要设计引物，进行PCR鉴定

怎么纯化霉菌？

我从植物中筛菌，但挑去菌丝后划线，一个平板中有3种菌落的样子，最表面是白色铺满的一层，背面看，还有橘红色和青色的块状物。

我该怎么分离出这三种？

还有一般的纯化霉菌的方法是什么？（求详解）

非常感谢！

无菌生理盐水无菌冲洗平板，稀释，取样涂布平板 形成单菌落镜检观察即可！具体梯度可根据预实验确定！

真菌DNA提取的方法

CTAB法提取步骤：

(1) 在7mL离心管中加入65℃预热的抽提液2.5mL。

(2) 加入1g样品液氮研磨，加入巯基乙醇50μL，上下震荡，使蛋白质变性沉淀， 65℃水浴1h，每隔10min颠倒混匀一次。

(3) 加入等体积（约3mL）的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(4) 取上清（约2.5mL）到7mL管，加1/5体积（约0.5mL）65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2mL的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(5) 取上清，加等体积（约3mL）的CTAB沉淀液，颠倒混匀。65℃水浴30min至沉淀可见。4℃平衡离心，10000 rpm，10min后小心去上清。

(6) 沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等体积（约0.5mL）的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)

抽提，4℃平衡离心，10000rpm，10min。

(7) 取上清加入2倍体积的无水乙醇（1mL），再加入1/10体积的NaAC （pH 5.2）约0.1mL。

(8) -20℃冰箱1h，4℃平衡离心，12000rpm，10min，弃上清，用70%酒精清洗2次，滤纸吸去多余水分，超净台吹干。

(9) 0.05mL TE溶解，-20℃保存。

我个人觉得SDS方法比较好，收集菌丝后加入钢珠，加入抽提液等，在涡旋仪上振荡，……，也能提取出不错的DNA。

CTAB、SDS法提都可以，我都提过，质量很好

加玻璃珠+酚：氯仿：异戊醇，震荡五-十分钟 效果也不错

94℃ 5min; 94℃ 30S， XX℃ 30S， 72℃ 50S （660bp 50S足以）(25-30cycles); 72℃ 7min

上图是用primer5.0设计的上游引物出现的cross primer的ΔG数值。请问这个引物能用吗？

能不能用只有试了才知道，不要迷信软件，尽量选评分高的，数值不超过5一般还是可以的

看文献的聚类分析图，不知道是如何作出来的？还有上面的数字是怎么标上去的？有序列，有软件，但我就是做不出那个样子的图来。如《番茄叶霉菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件研究》这篇文章里的聚类分析图，请问大虾们这图是怎么做出来的。先谢谢大家了。

这个是如下：

数字不是标上去的大哥，数字是利用N-J法构树的时候自动生成的，其意义类似于置信区间这样的一个概念，往往50%以下的部分都不要的。

用 几个软件结合起来做 效果挺好的。

先用 DNAMAN比对 修饰序列后，在用CLUSTER生成序列文件，最后在MEGA中生成系统树。你所说的数字 并不是自己标上去的，而是 在MEGA中自举检验你所做的系统树的置信度后所反映的值。

用MEGA软件建树时使用Bootstrap检验，可生成打分

16srDNA 怎么在ncbi上查询细菌的16s rDNA的全序列？

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide

搜索16s，再在右边选择bacteria

本虫做菌株鉴定方面，从形态学观察是某种真菌，下面打算用基因方面鉴定，请问可否用真菌通用引物ITS1和ITS4的PCR扩增产物测序，之后BLAST比对确定该菌株种属？

我们从老鼠内脏提取到细菌，我们要鉴定是什么细菌要做些什么过程呢？我是新人也查了些文献，这菌是好氧的，杆菌，革兰氏染为红色，我们提取到的菌可能是混合菌，要进行纯化（怎么纯化比较好），测定16sRNA，设计引物（不知道序列怎么设计啊？依据其他文献的引物可以吗？），谢谢各位，如果要知道的可以讨论或者赐教，我刚触及这方面的知识不是太了解，虽然自己也有看文献，希望有经验的各位能给我点帮助，谢谢

纯化最好的方法是划线分离，将你分离得到菌在平板上划线，尽量划得很开，是不是一种菌就一目了然了，你以后的操作就是挑取纯培养的菌落提取16SrDNA之后测序，细菌有通用的16SrDNA引物，上网搜细菌通用引物估计就能搜到了，之后测序的结果到ncbi

进行比对或构建进化树就好了

先做形态学的观察，再做生理生化实验，最后测16SrDNA序列，比对数据库。

第一次发帖，好紧张

自己筛了一株细菌，对其进行了诱变，拿到北京一个民营的菌种鉴定中心进行16srRNA的鉴定，结果出来后，去NCBI进行比对，发现诱变前后两株菌不是一个种，本来是想比较诱变前后基因序列的变化，现在显示竟然不是一株菌，心里那个凉啊。

我对分子生物学不是很懂，在这里请教一下高手：对细菌进行诱变后，会使细菌的种属发生改变吗？我还怀疑是不是鉴定中心的人给搞错了，他们说比对的时候减去前面的50个碱基和后面150个碱基，我不明白是什么意思？是不是前面50个碱基里有引物片段，不准确？

请高手指点。多谢了

我做抑菌一般用枯草芽孢杆菌作为受试菌，一般都是用LB 培养基培养：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏 5g，自来水1000 ml，pH 7.0 。其实LB 培养基是细菌培养的一个比较常用的培养基。