一、 前言：
1950年科學家發現噬菌體 (λ phage) 對大腸桿菌的不同菌株 (strain) 具有不同的感染能力。
1962年瑞士科學家Werner Arber等人證實E. coli K菌株可產生一種酵素能水解λ phage的DNA，因而稱為限制酵素。
1970年科學家開始利用限制酵素來處理自細胞分離出的長條型DNA，以得到固定大小的特定DNA片段，可應用在基因組結構與重組DNA的研究。
二、 目的：
1. 將分離得到的質體DNA，以不同的限制酶切割，經agarose膠電泳
分離DNA片段後，檢定質體圖譜或截切所需DNA片段，以進行重組質體DNA（recombinant plasmid DNA）之建構。
2. 載體DNA ：pBac-D-Pn539-E約7.2 Kb 與pET-21(+)約5.4 Kb ，
分別以限制酶BamHI與EcoRI切割來檢定plasmid的正確性。
三、 原理：
利用限制性內切酶切割DNA是DNA重組過程中的關鍵步驟之一。成功的酶切為後續工作提供了有效的實驗材料。限制性內切酶是細菌體內限制修飾系統內部切斷的內切酶。根據限制性內切酶的特性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。本實驗使用其中的Ⅱ型酶對DNA分子進行切割。
在酶切反應中，DNA的純度、緩衝液中的離子強度、Mg2+、pH值、作用
* *
濃度等因素均可影響反應，一般可通過增加酶的用量，延長反應時間等措施以達到完全酶切。
限制性核酸內切酶
（restriction endonuclease）能將雙股DNA切開的酵素。 切割方法是將糖類分子與磷酸之間的鍵結切斷，進而於兩條DNA鏈上各產生一個切口，且不破壞核苷酸與鹼基。 切割形式有兩種，分別是可產生具有突出單股DNA的黏狀
末端，以及末端平整無凸起的平滑末端。
由於斷開的DNA片段可由另一種稱為DNA連接酶的酵素黏合，因此染色體或DNA上不同的限制片段，得以經由剪接作用而結合在一起。
* *
限制酵素的單位
限制性內切酶的活性以酶的活性單位unit (U)表示，1個酶單位
* *
（Unit/ U）指的是在反應總體積為20μl，最適溫度條件下於一小時時間可將1μgDNA分解完全的限制酵素量。 限制酶的命名
限制酶的命名是以該酶來源的原核生物的名稱爲依據，即酶的名稱的第一個大寫字母取自於屬名的第一個字母，第二、三個小寫字母取自於種名的前兩個字母，字母後面的羅馬字則是簡單地表明該種生物中不同限制酶分離的先後順序。 限制酶名稱的書寫方式，前三個字母常用斜體或加下橫線表示。
例如， 分離自產色鏈黴菌(Streptomyces achromogenes )的兩種限制酶被分別命名爲SacI和 SacII。
若同一生物種內又分爲不同的血清型或菌株品系，其名稱則放在限 制酶名稱的第三個字母之後。
例如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的c和d血清型菌株。
限制酶的種類
➢ 已知的限制酶分為Type I、Type II與 Type III三類。
* *
➢ Type I與Type III限制酶同時具有endonuclease與methylase的活性。 ➢ Type I限制酶會隨機的切割距離辨識位置~1000 bp的序列，Type III則
只會切割距離辨識位置24~26 bp的序列。
➢ Type II限制酶，則會專一地切割所辨識的核酸序列的位置，一般可辨識雙
股DNA上特定的4~8個鹼基，並能在認知序列內的特定位點上切割雙股螺旋DNA。
➢ 每一種限制酶能辨識一特定的DNA序列並加以切割，但它不會切割細菌自
己的DNA，因為細菌 DNA 上的切割位置已被甲基化，稱為restriction-modification system。
➢ 不同的細菌中可純化出具不同專一性的限制酵素，可用來做基因剪接時的
「剪刀」，使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具，目前被廣泛應用於遺傳工程、基因選殖(cloning)和基因圖譜分析(gene mapping) 。
* *
➢ 第一型限制酶
同時具有修飾(modification)及認知切割(restriction)的作用；另有認知(recognize)DNA上特定鹼基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距離認知位(recognition site)可達數千個鹼基之遠,並不能準確定位切割位點，所以並不常用。例如：EcoB、EcoK。 ➢ 第二型限制酶
只具有認知切割的作用，修飾作用由其他酵素進行。所認知的位置多為短的迴文序列(palindrome sequence)；所剪切的鹼基序列通常即為所認知的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、HindIII。 ➢ 第三型限制酶
與第一型限制酶類似，同時具有修飾及認知切割的作用。可認知短的不對稱序列，切割位與認知序列約距24-26個鹼基對，並不能準確定位切割位點，所以並不常用。例如：EcoPI、HinfIII。
第II型限制酶
➢ 第II型限制酶只會辨認特定短的DNA序列，因此廣泛被應用於基因工程的
技術上，目前商品化的產品很多，可由生技公司購得。
➢ 此種限制酶會辨認長度4~6 bps (或更長) 等不同的核苷酸序列，很準確的
* *
在某一點上切DNA成對稱的兩軸交互分開，這種交互切口會使DNA片段的5’和3’懸空成sticky end (or cohesive end突出端)
* *
* *
常見的內限制酶及其辨認的切位
酵素名稱 來源 辯識序列 切法 5'---G 5'GAATTC AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' EcoRI Escherichia coli 3'CTTAAG 5'---G 5'GGATCC GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' BamHI Bacillus amyloliquefaciens 3'CCTAGG 5'---A 5'AAGCTT AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' HindIII Haemophilus influenzae 3'TTCGAA TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 5'---T CGA---3' * *
3'AGCT 3'---AGC T---5' 5'GCGGCCG5'---GC C GGCCGC---3' NotI Nocardia otitidis 3'CGCCGGC3'---CGCCGG G CG---5' 5'GANTC 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' HinfI Haemophilus influenzae 3'CTNAG 5'GATC 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---3' Sau3A Staphylococcus aureus 3'CTAG 5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' PovII* Proteus vulgaris 3'GTCGAC 5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' SmaI* Serratia marcescens 3'GGGCCC * *
5'GGCC 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' HaeIII* Haemophilus egytius 3'CCGG 5'AGCT 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' AluI* Arthrobacter luteus 3'TCGA 5'GATATC 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5' EcoRV* Escherichia coli 3'CTATAG 5'GGTACC 5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' KpnI Klebsiella pneumonia 3'CCATGG 5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' PstI Providencia stuartii 3'GACGTC Streptomyces SacI[ achromogenes 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' SalI[ Streptomyces albue 5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3' * *
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5' Streptomyces SphI phaeochromogenes 5'GCATGC 3'CGTACG 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' 5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5' XbaI Xanthomonas badrii 3'AGATCT * = 平滑末端(blunt ends)/鈍端切割(blunt end)；其餘為黏滯切割(sticky end)
限制酵素的使用
1. 單一酵素使用：注意buffer
2. 兩種不同限制酵素以上一起使用：選擇可使兩種酵素活
性反應達75%以上的buffer
先加低鹽的buffer作用一酵素，再加入高鹽的buffer
作用另一酵素
3. 當有多個樣品要用相同的酵素處理：配master
solution
* *
4. Inactivation of restriction enzyme： heat
phenol/chloroform/isoamyl alcohol
Star-activity：指限制酵素對所作用的DNA及序列失去專一性。當酵素辨認切割位的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，如六個變成只認四個，而產生錯誤的結果。
➢ 原因
✓ pH值過高(＞8.0) ✓ 離子濃度過低(＜25mM) ✓ 高glycerol濃度(＞5% v/v)
✓ 溶液中含有機溶液(如DMSO，酒精等)
+2
✓ Mg
被其他二價陽離子取代(如Mn
+2
,Cu
+2
,Co
+2
,Zn
+2
等)
* *
✓ 酵素(unit)與DNA重量(ug)的比例過高(每種酵素比例不同，但一般在＞100u/ug時)
四、 材料與設備：
A.材料:
質體: pBac-D-Pn539-E 、pET-21(+) 酵素: RNase A
Restriction enzymes
EcoRI 20U/μl buffer EcoRI BamHI 20U/μl buffer BαmHI B 儀器:
離心機、37℃的水浴槽
五、 問題與討論
* *
A. 請詳細說明限制酵素三種type 的特性？
➢ 第一型限制酶
功能：限制、修飾
特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因數；識別位點和切割位點不一致，無固定切割位點； 應用：不常用。 ➢ 第二型限制酶
功能：識別並特異切割DNA分子。 即通常所指DNA限制性核酸內切酶；
反應特點：僅需 Mg2+ 作催化反應輔助因數，能識別雙鏈DNA特殊序列，並可特異切割DNA，產生特異片段； 應用：種類繁多，分子克隆中最為常用
* *
➢ 第三型限制酶
功能：限制、修飾
特點：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因數；特異切割，切割位點在距識別位點3`端24-26 bp處。
應用：數量很少，無實際作用。
B. (1)何為restriction-modification system ？(2)細菌如何抵抗phage？(3)限制酵素為何不會切自己的DNA？
(1)大多數限制性內切酶常常伴隨有1~2種修飾酶（DNA甲基化酶），後者能保護細
胞自身的DNA不被限制性內切酶破壞。修飾酶識別的位點與相應的限制性內切酶相同，它們的作用是甲基化每條鏈中的一個鹼基，而不是切開DNA鏈。甲基化所形成的甲基基團能伸入到限制性內切酶識別位點的雙螺旋大溝中，阻礙限制性內切酶發揮作用。這樣，限制性內切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成R-M系統。 在某些R-M系統中，限制性內切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能；另一些R-M系統本身就是一種大的限制-修飾複合酶，由不同亞基或同一種亞基的不同結構域來分別執行限制或修飾的功能。
1.
定義
* *
限制修飾系統（Restriction modification system 或 R-M系統）是一種存在於細菌（可能還有其他原核生物），可保護個體免於外來DNA（如噬菌體）侵入的系統，主要由限制內切酶和甲基化酶組成的二元系統。
2.
結構編
細菌的限制修飾系統包含三個連鎖基因： （1）hsd R：編碼限制性核酸內切酶 （2）hsd M：編碼限制性甲基化酶
（3）hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協同表達
3.
作用機制
有些細菌體內含有限制酶，可將雙股DNA切斷，之後其他的內切酶再將切下的片段降解，因此能將入侵的外來DNA摧毀；
有些病毒則演化出對抗此系統的機制，它們的DNA經過了甲基化或糖基化的修飾，可阻礙限制酶的作用；
另外還有一些病毒，如T3及T7噬菌體，則合成出一些可抑制限制酶的蛋白質； 而為了進一步對抗病毒，有些細菌演化出專門辨識並切割已修飾DNA的限制系統。
(2)宿主菌對噬菌體的天然抵抗機制分為4個主要的類別：吸附抑制、流產
感染、限制-修飾系統和穿入阻滯。
1. 吸附抑制(absorption inhibition)
* *
最有效的防禦即是阻止phage與其之間的任何物理性接觸，這可以通過細菌細胞壁上phage的受體突變，或者可以更有效地通過分泌阻止phage接近的屏障，如：莢膜、黏液層來實現。 ex：通常情況下 T phage可以吸附在E.coli B和 K-12細胞壁的特殊位點上並進行轉錄，E.coli B和 K-12的一些突變株在細胞壁上表達過多的多糖莢膜，這些過多的莢膜覆蓋了細胞壁上phage的受體位點，從而產生了對T phage的抵抗作用；而抑制莢膜形成的E.coli B和 K-12的11011.9的突變株就能抑制T
phage的抵抗作用，該突變株可能由發生在non-9的等為基
因上的組蛋白相關的突變形成。
2. 流產感染(abortive infection / Abi)
流產感染(Abortive infection Abi)系統(也稱噬菌體排斥系統)是在噬菌體的不同發育階段干擾噬菌體增殖的一種機制。在噬菌體感染的過程中，噬菌體的吸附和 DNA 注入正常發生，只是後續發生的噬菌體發育過程被終止。由於噬菌體的侵入，幹擾了宿主細胞的正常生理功能，導致了被感染宿主細胞的死亡，進而終止了噬菌體的增殖，被感染細胞的死亡阻止了噬菌體的擴散，為周圍細胞的生存提供了保護。
* *
Abi 系統多數編碼在質粒或前噬菌體上，常常由單一宿主基因所介導。
ex：在λ噬菌體溶源性的大腸桿菌中發現的 Rex 系統是目前為止
研究最清楚的Abi系統
3. restriction-modification system
限制修飾(Restriction-Modification RM)系統是最早發現的細菌免疫系統，典型的 RM系統由限制酶(REase)和甲基轉移酶(MTase)構成，它們通常成對出現，具有相同的 DNA 識別位點。REase 識別並裂解特定的 DNA 序列，同源的 MTase 對同一識別位點上的腺嘌呤或胞嘧啶進行甲基化，保護 DNA不被REase 裂解。 正常情況下，含有RM的細胞在DNA複制過程中被甲基化，而外來核酸 ( 如噬菌體和質粒DNA)的甲基化模式與細菌本身的甲基
* *
化模式不一致，就可能被細 菌 的特定限制酶所降解。編碼RM 系統的基因定位在質粒或染色體基因組中。
RM 系統是細菌免疫防禦的胞內第一道防線。在噬菌體或移動遺傳元件尚未複製之前就降解其DNA 是 RM 系統作用的突出特點之一。
4. 穿入阻滯
由p NP40的編碼的早期發生作用的phage抵抗機制，可以排除經典的吸附受阻、restriction-modification system、流產感染(p NP40同時還編碼流產感染機制)，他可以被以下幾個證據支持：
➢ Phage吸附到MG1614/ p NP40與其吸附到敏感宿主上有相同的吸附效率，
電鏡觀察發現這種附著是用正常的尾先定方向進行的
➢ 感染結果只有10﹪的含p NP40宿主菌死亡，提示這種p NP40編碼的抵
抗機制的作用必定先於受感染後宿主功能的喪失和DNA的降解
➢ Phage基因組進入含有p NP40的宿主後的內在化被延遲或削弱，這即是
至少在感染後30min內不能檢測到phage特意DNA的證據，而在敏感宿主中感染後5min即能檢測到
➢ 通過電穿孔將phageDNA引入抵抗宿主中造成是感染後早期階段假象也能
到ECOI的顯著增加，這支持早期即發生作用的p NP40編碼的抵抗作用在phageDNA穿入細胞階段上發揮作用的觀點
* *
(3) 因為當細胞內含有某種限制性內切酶時，細胞本身會有相應的保
護措施。比如細胞基因組中沒有該限制性內切酶能識別序列的序列(這種情況應該是比較少的)；主要的是細胞內能通過甲基化修飾來保護自身DNA不被自身限制性內切酶酶切。
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