鲎试剂检测细菌内毒素的体会

姚巍;杜宏伟

【摘 要】细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。

【期刊名称】《黑龙江科技信息》 【年(卷),期】2012(000)008 【总页数】1页(P45-45)

【关键词】细菌内毒素;鲎试剂;细菌内毒素检查法 【作 者】姚巍;杜宏伟

【作者单位】哈药集团制药总厂,黑龙江哈尔滨150086;哈药集团制药总厂,黑龙江哈尔滨150086 【正文语种】中 文 【中图分类】TQ460.7

细菌内毒素是微生物的一种代谢产物，能引起恒温动物和人体体温异常升高，其中革兰阴性杆菌所产生的内毒素致热活性最强，很少剂量即能引起广泛的生物效应及病理作用，严重时甚至危及生命。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》、《欧洲药典》《日本药局方》、《中国药典》等相继收载了该方法。2000版《中国药典》更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。鲎试验因其简单、快速、灵敏、

准确的特点，被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定法为细菌内毒素检查法，细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。现将鲎试剂检测细菌内毒素的体会介绍如下。

鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。

1.1 按原料来源分。是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate），缩写为LAL，由美国生产；另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate），缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。

1.2 按实验方法分。细菌内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为：凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。

凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。 1.3 按使用特点分。

1.3.1 普通鲎试剂。灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。

1.3.2 高灵敏度鲎试剂。灵敏度0.06～0.015EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。

1.3.3 特异性鲎试剂。灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰的样品。

1.3.4 定量法鲎试剂。最低检测限0.03～0.005EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

一般最常用的是家兔发热试验法（RT）与鲎试验法（LT）。RT为一种定性检测内毒素的方法，应用历史悠久，有很多限制，如家兔对内毒素反应上有个体差异，敏感度不高、耗时、不能定量检测等。LT具有快速、简便、敏感度高、假阳性少、试剂耗费少等优良，可广泛应用于注射剂的热原控制，组液法对非内毒素引起的热原则不敏感。

内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[2]，而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以，一定要严格执行鲎试剂的质量标准，规范使用鲎试剂。

3.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。

3.2 鲎试剂的非特异性内毒素不是唯一能激活鲎试剂凝集系统的物质，还有其他物质可以通过G因子这个“旁路”激活鲎试剂的凝集系统。因此鲎试剂并不是专一对内毒素反应的试剂。由旁路反应产生的阳性结果称细菌内毒素检查的“假阳性”。 3.3 影响细菌内毒素检查的因素。

3.3.1 混合液的pH6.0～8.0才能形成最佳凝集。 3.3.2 保温温度：温度应为（37±1）℃[3]。 3.3.3 保温时间：（60±2）min[3]。

3.3.4 在鲎试验过程中应防止使试管受到振动。 3.3.5 所用器皿均应彻底洗涤和冲洗干净。 3.3.6 阳性对照存在。

3.3.7 鲎试剂的贮存。虽然冻干的鲎试剂在常温条件下是相对稳定的，但还是应存放在2～8℃下，避免长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当、质量下降而引起的检验误差。

4.1 当夏天室温较高时，控制鲎试剂使用过程中温度的变化，可通过在冰水浴中进行加样以取得较好效果；同时，实验操作从鲎试剂的复溶到放入恒温仪应尽量在1.5h内完成。

4.2 虽然目的鲎试剂相对稳定很多，但还是应存放于2～8℃的条件下，并保持温度的稳定，如冰箱发生故障，无法保持温度时，就应及时换贮存设备。 4.3 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放置在冰冷的表面上或于2～8℃的冰箱内存放24h以内；亦或在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下，可存放28天，但只能冻融一次。

细菌内毒素检查法作为一种新技术载入药典，成为一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着历史的发展，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。它具有方法多样化、自动化、微量化的特点。细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比家免热原检查法更适应现代制药工业的发展。它可以应用于药检，也可以用于药品生产质量控制、临床诊断及其它领域。该法用于药品成品的检查，属于一种事前控制的质控手段，对提高药品质量，避免造成药品成批报废有重要意义；在临床上可作为快速诊断革兰氏阴性细菌感染的疾病的一种辅助方法，但不能区分病原体。

【相关文献】

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2]梁苹，蔡红.鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量检查的影响[J].华西药学，1999，14（3）：204-204.

[3]张红霞，陈慧，马金刚.影响鲎试剂灵敏度测定结果因素的分析[J].中国药师，2007，10（8）：825-826.