LAMP在临床微生物检测中的应用及进展

􀅰１１１􀅰

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PaucitfnaturalkillerandctotoxicTcellsinhumanyoy

,neuromelitisoticalesions[J]．Neuroreort２０１２,２３ypp():１８１０４４Ｇ１０４７．

ofILＧ６ＧroducinonＧclassicalmonoctesinneuromeliＧpgnyy

],tisoticasectrumdisorder[J．JNeuroinflammationpp

４９３Ｇ５０６．

[]M,３２ICHAELBD,ELSONEL,GRIFFITHSMJetal．

PostＧacuteserumeosinohilandneutrohilＧassociatedcＧppy

/tokinechemokineprofilecandistinuishbetweenpaＧgandidentifiespotentialpathohsioloicalmechanismsＧapyg

],():ilotstudJ．Ctokine２０１３,６４１９０Ｇ９６．py[y;tientswithneuromelitisoticaandmultilesclerosisypp[]Z３３HANGH,VERKMANAS．Eosinohilpathoenicitpgy

]mechanismsandtheraeuticsinneuromelitisotica[J．pyp

,():JClinInvest２０１３,１２３５２３０６Ｇ２３１６．

()收稿日期:２０１８Ｇ０８Ｇ０４　修回日期:２０１８Ｇ１０Ｇ１０

[]P３１APADOPOULOSMC,BENNETTJL,VERKMANA

:S．TreatmentofneuromelitisoticastateＧofＧtheＧartandyp

􀅰综　　述􀅰

],:emerinheraies[J．NatRevNeurol２０１４,１０(９)ggtp

LAMP在临床微生物检测中的应用及进展

郭　绮１综述,杨甦庆２△审校

()重庆市药品技术审评认证中心,重庆４重庆医疗器械质量检验中心,重庆４１．０１１２０;２．０１１４７

是在等温条件下对目标D　　摘　要:　环介导等温扩增技术(LAMP)NA序列进行扩增的一种技术.在临床

、微生物检测方面,生化鉴定、逆转录聚合酶链式反应(核磁共振等技术比较,具LAMP与染色镜检、RTＧPCR)

有方法简单、特异度强、便于观察结果、不需要精密仪器等优势,是一种非常有价值的检测技术.该文主要对并对其应用的优缺点进行了分LAMP的终点检测方法及LAMP在临床微生物检测上的应用及进展作一综述,析,旨在为检验人员选择LAMP作为临床微生物检验手段提供参考.

关键词:核酸扩增技术;　细菌;　病毒;　寄生虫;　敏感度;　特异度

:/DOI１０．３９６９．issn．１６７３Ｇ４１３０．２０１９．０１．０２９j

()文章编号:１６７３Ｇ４１３０２０１９０１Ｇ０１１１Ｇ０５

中图法分类号:R４４６．５

文献标识码:A

(,,RTＧPCR)andnuclearmaneticresonance(NMR)LAMPhastheadvantaesofsimlicitstronecificiＧggpygsp

teasbservationandnoneedofrecisioninstruments．Itisaveraluabledetectiontechnolo．InthispaＧy,yopyvgy,ertheendpointdetectionmethodofLAMPandthealicationandproressofLAMPinclinicalmicroorＧpppg

,anismdetectionarereviewedandtheadvantaesanddisadvantaesofthealicationareanalzed．ThepurＧgggppyoseofthisarticleistoprovideareferenceforexaminerstoselectlamsameansofclinicalmicrooranismppag

detection．

:;;;;;Keordsnucleicacidamlificationtechniue　bacteria　virus　parasite　sensitivit　secificitpqypyyw的关键是链置换　　环介导等温扩增技术(LAMP)

]１

.与一般的D型合成酶、引物及终点检测方法[NA

聚合酶不同,链置换型合成酶能催化引物以双链合成一条与之互补的链,DNA的一条链为模板延伸,

替换另一条链.为保证核酸扩增的特异度与灵敏度,

△

DNAseuencesunderisothermalconditions．Itisahotresearchtoicinrecentears．Inclinicalmicrooranismqpyg

,,,detectionComaredwithstaininicroscobiochemicalidentificationreversetranscritasechainreactionpgmpyp

(１．ChoninechnicalCenteroruvaluationCertiication,Chonin４０１１２０,China;gqgTfDgEfgqg,２．ChoninualitestinnsectionCenteroedicalDevices,Chonin０１１４７,China)gqgQyTg&IpfMgqg４

:Abstract　LooediatedIsothermalAmlification(LAMP)isatechniueforamlificationoftaretpmpqpg

ThealicationandproressofLAMPinclinicalmicrooranismdetectionppgg

１２△,GUOQiYANGSuinqg用于识别DLAMP的引物至少需设计４条,NA模板

的６个不同区域.在产物检测方法方面,LAMP主要通过监测颜色变化评价反应.近２研究者们０年来,开发出了引物设计软件,发现了新型链置换型合成酶,优化了产物检测方法,还设计出了多重LAMP及

]():郭绮,杨甦庆．国际检验医学杂志,　　本文引用格式:LAMP在临床微生物检测中的应用及进展[J．２０１９,４０１１１１Ｇ１１４．

:　通信作者,EＧmail５１６６８８０４８＠q．com.q

􀅰１１２􀅰

,,,国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期　IntJLabMedJanuar０１９Vol．４０No．１y２

逆转录L每一次技术的突破,均推动了LAMP,AMP在临床微生物检测领域的应用.

１　LAMP技术原理及检测方法发展１．１　LAMP扩增原理　LAMP反应开始后内引物上游引物(由F的FFIP,２和F１c组成)２区与靶DNA)的F在链置换D聚合酶作２c区杂交,NA聚合酶(Bst伸,取代FIP连接的互补链.互补DNA单链被置换脱离后F然后作为内１c和F１区互补配对形成茎环,用下,合成１条FIP连接的与靶DNA互补的DNA单链,然后外引物F３与靶DNA的F３c区杂交并延引物下游引物(由B的模板.BBIP,２和B１c组成)IP已被用于克氏锥虫、丙型肝炎病毒、人LAMP染色剂,

３Ｇ４]

乳头瘤病毒、人冠状病毒[等病原微生物的检测.其不仅可在恒温孵育前加入,且结果通过紫外线、自１．２．３　浊度法　浊度法可对反应产物进行定性和定量检测,原理为反应产生的副产物与反应溶液中的２＋

生成白色沉淀,既可通过目视法检查浑Mg反应,浊,也可通过在特定波长下监测沉淀的生成定量检测

扩增产物.目前,市面有实时检测LAMP反应的浊度仪,如LAＧ２００、LAＧ３２０和LAＧ５００.采用浊度法检测的临床微生物有肺炎支原体、人乳头瘤病毒及艰难]５Ｇ６

.然光均能观察到[

的B２区与模板与模板A的茎环结构DNDANA的互补B的１c区杂交,合成并１条打开BIP连接的.随后,取代B３D与模板NA单链,模板NDNAB３c区域杂交并延伸分别B在IP连接的互补链.此补链脱落,两端形成茎环,得到一BI个P连接的互哑NA链,.这种结构作为铃状的其过程见图１LAMP扩增循环阶段的模板,最终得到的产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物(靶DNA的交替反向重复序列)

.图１　　LAMP哑铃状模板构造的形成过程

．２　LAMP的终点检测方法测中的一大优势是结　L果AM观察P应用在临床

微生物检方便、简单.AMP在临床微生物检测中用的终点检测方法有浊度法、琼脂糖凝胶电泳相应LF的D优)

缺点,在选物法取进、检行显测探色方针法法分及时析横要等向根,流各动据方试实法纸际具条法(、对扩增产情备况考量.

．２．１　琼脂糖凝胶电泳法.　琼脂糖凝胶电泳是AMP设计初期采用的方法因为检测过程中需打开反应管,易导致气溶胶溢出,增加携带污染的风险,且琼脂糖凝胶制备过程中用到的荧光染色剂—

——溴化乙锭是一种对人体有致癌作用的高危险化学物质,因此,其应用受到一定的限制.

．２．２　显色法　用于LAMP显色的染色剂有钙黄

绿素、羟基萘酚蓝(Ⅰ)等.SYBRGreenHNⅠB在)、恒荧温光孵染育料前(S加Y入BR,

抑Gr制ee反n

应,在恒温孵育后加入易引起气溶胶污染[２

]染料可在恒温孵育前加入,但.HN能用肉眼观察颜色变化.钙HN黄B不能发射荧光,

仅B

绿素是最常用的

梭菌等[

７Ｇ８

]１．２．４　LF.D　LFD由于成本低、使用方便、简单、快速、轻便等优点而成为目前最受青睐的技术之一.只需将待测样本滴加于结合有端(样品垫)就能L进AM行P缓冲液和生物素的试纸条一检测.其原理为利用异硫氰酸荧光素(扩增产物杂交后FITC)标记的９D与胶体金标记的NA探针与生物

素标记的抗LAMP[]具有生物素抗体的检测线捕获并显示结果FITC抗体结合形成复合物,被横向流动试纸条上[１０

]１．２．５　对扩增产物进行探针分析.探针及电化学传感器正广泛用于RAZ等１

D　纳米金作为光学

NA检测领域[１

１]

D[２]

应用纳米金探针对肠炎沙门菌扩增产物.进行标记,然后用莱卡显微镜采集表面增强拉曼光谱

进行分析.结果显示,该方法的灵敏度(比传统的PCR法提高了１００倍,具有较高的特异性６６CFU/mL)

,可将其与密切相关的细菌或非特异性污染的.

DNA区

分开来２　LAMP在临床微生物检测中应用及进展

２．１　LAMP在细菌检测中的应用及进展被成功用于检测人体感染的细菌,如结核分　L枝杆AM菌P、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等,且不断有新的细菌反应体系的构建.某些用传统方法检测有困难的细菌,在建立了特异性并快速得到结果.肺L炎AM链P反应体系后可成功检测球菌的传统诊断方式为染色镜检,但在样品采集和处理过程中肺炎链球菌的自溶酶系统易使其快速死亡,导致检测难以

进行.诊断的XLIAMA等[１

３]建立了一个对肺炎链球菌进行实时P反应体系,利用实时荧光检测装置,对肺炎链球菌ATCC４９６１９的DNA进行检测,结果显示,该反应能在续球菌和其他１０min,检测限为２０min扩增得到结果荧光峰通常持１５株非肺炎链球菌３００pg/μL,.且能有效区分肺炎链,

在拓宽检测病原菌种类的基础上,断地创新,多重LLAMMAP在检测病原菌的技术方面也不

P的应用不仅缩短了病原菌检测时间,且可区分２个甚至多个病原菌.沙门菌和副溶血性弧菌是人类最常感染的食物传播病原体,如能对从疑似病例上采集的样本同时进行这断食源性感染疾病非２个病原体的快速检测,对判常有意义.

DD１L１L１,,,国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期　IntJLabMedJanuar０１９Vol．４０No．１y２

[４]

建立了一种多重实时循环介导的等温扩增LIU等１

方法,该方法结合熔融曲线分析,允LAMP(mLAMP)

许在６值对扩增０min内根据不同的解链温度(Tm)

􀅰１１３􀅰

且满足低成本、便携性和易用性的实际要求,具有用

于检测其他病毒的潜力,让病毒载样量的检测可在患者家中及临床实验室中用手指血进行.新型OmniＧ

的发现是RAmNA聚合酶(POL)TＧPCR的一次pD

１９]

.与传统D)检测前景更加广阔[和NA聚合酶(Bst

产物进行检测和鉴别.该研究共分析了１９株已知的

细菌,包括１株副溶血性弧菌参考株(ATCC１７８０２)和７株沙门菌属.结果显示,副溶血性弧菌的Tm值为８平３．８℃,７株沙门菌的Tm值为８６．５~８６．８℃,均(对非沙门菌和非副溶血性弧菌８６．６１±０．１１)℃,株未获得Tm值,未发生扩增,表明mLAMP能特异性检测和区分沙门菌和副溶血性弧菌.LAMP不仅

)重要革新,其替代了D和逆转录酶,NA聚合酶(Bst

实现靶R让RNA的单酶检测,TＧPCR在病毒方面的逆转录酶比较,该酶受全血成分的抑制作用较小,对稀释的低病毒血症样品的检测速度更快,具有更高的耐热性和较好的干燥条件,可延长常温下的储存时间,更适于侧流装置和冻干LAMP反应管的研制.可对细菌进行鉴别,还可解决细菌的分型问题,传统

血清学分型易受细菌表面抗原表达量的影响.另外,抗生素的不当使用,导致临床标本中存在抗生素,能

培养出的细菌量很少甚至没有.AMP法进行脑膜炎血清群特异LE性E等[１

５]

首次采用鉴定试验,对例脑膜炎球菌阳性脑脊液标本进行检测,结果显示３１,CR检测的检出限为每反应１０３~１０４个基因组拷贝,LAMP分析的检出限为１０~１０３P的灵敏度较１例样本中的P２C９R提高了约０个基因组拷贝,AM例成功分型１,０其中０倍.且在内对型各A、２h．２　L５株,AMPW型在病毒检测中的应用及进展６株.B、C、X、最常用的方法是逆转录环介导的等温　病毒检测

扩增(RTＧ

通过AMPDN),A利用逆转录酶从聚合酶进行进一步扩增RNA中获得互补.DNA,并酶(育,可一步完成检测Bst聚合酶和逆转录R酶TＧ)

L在AM恒P将所有的引物和温下孵[１６

](热病毒、流感病毒病毒等.、丙型肝炎病毒,已用于检测各种病毒、埃博拉病毒和寨卡

,如登革

革热病毒ZIKA)２种血清L[７]研发出一种快速检测登型AU等１

的单管一步法RTＧLAMP检测系统,该方法设计了针对登革热病毒的每一种血清型的LAMP引物集,

并将引物集及其他反应需要物质加入到一个后就能检测出LAM加入样本反登革P反应管中,应热病毒.研究样本为登革３热０感mi染n者血清,反应过程通过环介导实时浊度仪结果显示,该方法的检测限低至拷贝,在１８９个样本中检出１１５个阳１性０个目的LAＧ３２样本,

检R０监测.出N率A较实时荧光定量聚合酶链式反应(RTＧ高交叉反应５％,

且与样本中登革热病毒特别相似的虫酶病毒无q

PCR).此种单管一步法PRＧLAMP虽然不能区分登革热病毒的血清型,但可迅速判断登革热病毒感染与否,具有临床实用性.目前,RTＧLAMP最成功的应用之一是诊断人类免疫缺陷病毒(病毒.HI成本和复杂操HIV)逆转录,V病毒载量的检测受到规模、作的限制开发一个能使病毒载量更易获得的技术非

常迫切.DAMHORST等[１８]利用微流控芯片和硅微芯片平台,对经最小处理的HIV全血样品进行RTＧ

示AM,RTPＧ,

L并在移AMP动能检测到微量全血样品中的智能设备上进行荧光测量H,I结V果量显,

其利用测,在POL对６种RNA病毒进行了RTＧLAMP检变３０m用于in内扩增出了所有靶标,不需额外步骤,也不改RTＧLAMP聚合酶更具有优势DNA靶标的反应设计.,更适于恶劣环境下的POL较传统

病毒诊断,为．３　LAMPL在寄生虫检测中的应用及进展AMP的便携化发展奠定了基础.

因之一.L现AM场P在寄生　寄生虫

是世界主要的死亡原虫检测

中的应用为寄生虫临床样本的检测和在寄生虫感染早期的及时检测提供了有效手段.等[２０]采用LAMP法对ZHANG

检测限低至每微,３升L０例恶性疟原虫临床标本进行了检测,结果显示AM５个P检测阳性率可高达

寄生虫,且对间日虫０％疟原、约氏疟原虫和弓形虫的基因,

组呈阴性,具有较强的抗干扰能力.DNA的检测结果

[１]

R测方法F４基因为目标,了一种高灵敏PO度O的LE等２以研制,结果显示,RF４特异度LAMP能在L３０mAMiP检n内

检测到L１条微丝蚴(１０.N[２]

采用行了测试AMP检测了利什曼原虫０,p对g.结果显示,DNA拷贝,灵敏度至少是常规LAMP１)

２ZELU等２能２份疑似临床样本进

有效检测到PCR的１００倍１.０１个

这对利什曼原虫感染早期,其密度很低时的检测是非常有

意义的.有研究利用mLAMP与斑点酶联免疫吸附试验(亚洲带绦虫的鉴别dotＧELISA)相结合,以细胞色素,进行猪肉绦虫、牛肉绦虫和为靶标,分别采用明(TAMRA)标记FIFTIPC、引地高辛C物和生(氧化酶亚基D物IG素)标和四甲基罗丹１基因记BIP引物进行单管通过dotＧEmLLISAMAP反应.每个物种的针对如果用传统的方法鉴别FITC、DIG或TAMmLRAM,AP产物的特异性抗体进行区分.一个样品需３个反应混合物,既耗时又复杂,并增加了交叉污染的风险.带绦虫的鉴定更加简单mLAMP法与、实用dotＧ[

２E３

]L.ISA相结合,可使人　　L　LAMAMP的优缺点分析

P作为临床微生物检测手段具有快速、

适合推广、特异性强等优点.AMP不需传LAM统PP最显著的优点是其快速性,由于LCR中始热变性过程,所以,较传统,可实现立即诊断.LAMPCR减少了约DNA模P的另一个优点是推

２/板的初

３的反应时间LPLYL２２９１３L􀅰１１４􀅰

,,,国际检验医学杂志２０１９年１月第４０卷第１期　IntJLabMedJanuar０１９Vol．４０No．１y２

广性强,与其他扩增反应比较,只需简单水浴或金属浴等提供恒温条件,且结果评价可进行肉眼观察.有研究者结合缓冲液中B研制stDNA聚合酶的特点,出了一种用于LAMP的pH敏感染料.pH敏感染料根据LAMP扩增过程中pH从碱性到酸性的变化监测L易于观察,进一步提高了LAMP反应,AMP结.L不受AMP的检测特异性强,与靶DNA相似度高的非靶DNA及PCR抑制剂的影响,如血液的检测可在不需要模板提取步骤和未经处

]２５

.理样本的情况下进行[果观察的便利性

[２４]

[],():thermalamlificationJ．ClinLab２０１７,６３３４９５Ｇ５０５．p

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McolasmapneumoniaewithpetidenucleicacidＧmediaＧypp

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:mediatedisothermalamlificationAninnovativegeneamＧp

,lificationtechniueforanimaldiseases[J]．VetWorldpq

inlihtonLAMPassasＧAcomarisonofLAMPvisuＧgagyp

[]alizationmethodsincludinthenoveluseofberberineJ．gtectionprocedureformutationsinthe２３SrRNAgeneof

尽管L但仍有一些限制因AMP具有很多优势,

素阻碍其顺利应用.由于LAMP扩增后得到的产物是１条大的的,通D不适于除鉴定外的其他分子生用NA链,物学目性较PCR低.为提高扩增灵敏度和特异性,引物的设计较复杂且受到限制.尽管目前已有免费的引物设计软件,但为保证选择到优选目标位点,仍需人工参与引物设计.另外,多个引物的使用

将增加引物之间的杂交概率,产生假阳性结果[

２６

]LAMP的反应产物非常稳定,

不易降解[６].成气溶胶污染,且,易形性产物污染也会对结果产生影响LAMP灵敏度高,即使极少量的阳,这就对操作过程提出了较高的要求[

２]

　展.　　随着造成　　望

感染性疾病的微生物种类日益复杂和耐药菌甚至多重耐药菌的剧增,微生物鉴定变得越来越困难,因此,需不断更新诊断方法.在种类繁多的基因扩增技术中,LAMP以其快速、

灵敏、特异度高等优点促使研究人员不断探索其在临床微生物检测中

的应用.到目前为止,已开发了冻干形式的试剂和商业化用于微生物特异性检测的LAMP,但离便携式由于LAMP产品的商业化还有一段距离LAMP试剂

盒.

测所需LAM且具有实时检的所P易于适应任何现场环境,有特性,相信随着便携式LAMP产品的进一步发展,围会更加广泛LAM,为基层医疗及恶劣环境下的病原微生P在临床微生物检测领域的应用范物检测提供了有价值的工具.参考文献

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