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his蛋白纯化操作步骤全

2021-08-13 来源:客趣旅游网


His蛋白的纯化

一 目的蛋白样液的收集

1:-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌

2:菌种复苏,将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基),以未加菌的K+ LB培养基作空白对照, 37度摇床培养12-16h。

3:扩大培养,将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6(2h左右)

4:诱导表达,扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg,使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h,置-70度保存或立即进行下步操作 5:收集包涵体,离心,5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存) 6:溶解包涵体,用PBS重悬细胞沉淀(约每毫升沉淀加5mlPBS),放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌(有效时间30-40min,超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性)

7:蛋白提取液的收集,离心,5000r 15min取上清(可4度保存),菌体保存,测菌体中目的蛋白含量大小使用

8:介质处理,取出底帽滴出多余液体,柱子顶部朝上直立固定好,蒸馏水洗涤一次,再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子,最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。

9:介质与核酸结合,从柱子上部加入蛋白提取液,4度旋转混匀1h,收集

流出液(若需要流出液再重新过柱一次,以最大限度提高结合力)

10:取10ml 1*binding buffer洗树脂,洗2次,流出液标记洗涤顺序保存 11:样品的收集,取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10,每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴(第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可,若需要可适当增加)

12:树脂的保存,若样品体积大于柱子体积,树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用,若不使用可用蒸馏水洗涤树脂,加入20%乙醇10ml -20度保存(一种蛋白树脂可重复使用,注意不要超过树脂的结合能力)

二 检测收集的样品中目的蛋白量的大小

13:取13个1.5mlEP管,分别标记1#,2#,3#……10#,A,B,C从1号EP管内取30ul样液于1#号EP管内,依次移取至10号于10#号,取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中,取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。(此步骤结束后将收集的样品放4度保存,防止蛋白快速降解)

14:取5*的loading buffer7.5ul加入标记1#-10#,A,B,C EP管中将其稀释成1*loading buffer

15:置100度电热器加热10min,取出后将其蒸发的水分离沉。(可-20度保存)

16:电泳,安装好后加1*的蛋白电泳液,拔出梳子,一孔加3.5ul蛋白marker,

剩余孔加样10ul,跑浓缩胶80,分离胶120。

19:考马斯亮蓝R-250染色液染色 20:考马斯亮蓝染色脱色液脱色(可4度保存) 21:照相

LB培养基的配置:nacl 10g, 蛋白胨(tryptone)10g, 酵母提取物(yeast extract)5g配置成1L高压 蛋白胶的配置:1安装好后用水试漏,倒出水后用吸水纸吸出剩余水分2按说明配置相应浓度分离胶3加分离胶每板7ml左右,分两次加水补满等待其凝固4凝固后倒去上层水分残留水分吸水纸吸取5按说明配置相应浓度浓缩胶6加入3ml左右浓缩胶7加入梳子等待其凝固8取下放于4度冰箱保存(多个中间用湿润吸水纸间隔)

三 样品密度的测定

BSA法测蛋白密度

1:使用注意1) BSA Standard Solution使用前室温放置,恢复至室温或在20-50度水浴中复温,轻弹混匀。

2)BCA ReagentA 和 BCA ReagentB在低温下可能会产生沉淀。使用前20-37度保温,轻轻震荡混合

2:工作液的配置,BCA ReagentA : BCA ReagentB=100:1(例30ml工作液的配置,在30ml BCA ReagentA中添加0.3ml BCA ReagentB)充分震荡混匀。可4度存3天使用

<200ul反应体系>所需工作液总体积(ml)=(BSA标准溶液8份或7份+检测样品数+1)*0.2

2mg/mlBSA Standard (ul) 120 90 60 45 30 15 10 0 稀释液(PBS) 0 30 60 75 90 105 150 120 BSA终浓度(ug/ml) 2000 1500 1000 750 500 250 125 0(Blank) 根据上表BSA标准品溶液的稀释方法制备BSA标准曲线20min内检测完 1:使用微孔板测定,BSA标准品溶液添加量25ul,待检测样品添加量25ul 2:加入200ul工作液,混匀 3 :37度30min

4: 测630nm处的吸光值

5:各浓度BSA标准品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值,绘制BSA标准品溶液的标准曲线

6:各样品溶液的吸光度度值减去Blank值的平均值,根据标准曲线可计算出检测样品的蛋白浓度

四,稀释到1mg/ml分装-70度保存

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