神经胶质瘤组织芯片制作中影响因素的分析

󰀀492󰀀l临床与实验病理学杂志JClinExpPathol2008Au24g；(4)神经胶质瘤组织芯片制作中影响因素的分析霍红梅翟德忠朱，，卿钱志远，关键词：神经胶质瘤；组织芯片自苏州大学三所附属医院南通大学附属医院和甘肃省定西，中图分类号：R446—．8文献标识码：B—市人民医院病理科02，。正常人脑组织11例人胚胎脑组织，、12文章编号：10017399(2008)04—0492例体外培养的人脑胶质瘤细胞系体、SHG44GBM多细胞球、SHG44细胞裸鼠皮下移植瘤以及脑肿瘤干细胞球体神，。随着新的基因和蛋白分子的不断被发现对其功能的进，一经干细胞球体各4例由本研究室提供石蜡(德国。Leica公抗步研究最终都将回到组织学水平，。因此先进的组织学，司熔点，58℃)；蜂蜡(上海华灵公司)DakoCDC2。、cyelinB1研究方法即组织芯片(tissuechip)技术就显得尤为重要”J。体及免疫组化试剂盒均购自丹麦12．产品公司为更好地掌握这片的成功率1一实验技术我们通过不断地摸索和实践，，仪器方法．组织芯片仪为上海博南公司15．TMA600型配套，尽量减少制作过程中各种因素的影响总结经验以提高制，，。点样针直径13．mm；切片机德国LeicaRM2145型。13．1，供体标本处理。组织标本均经一10％HE，中性福尔马林，材料与方法．液固定石蜡包埋每个蜡块制作张切片由病理专切112000材料与试剂供体组织人胶质瘤标本，79例(WHO13家在显微镜下将病变的典型部位进行定位在切片上标记相关区域然后将该切片和石蜡组织块进行比较依靠，，标准I级9例Ⅱ级30例Ⅲ级，27例Ⅳ级，例)来，HE片上的标记在石蜡组织块同收稿13期：2008一部位做一标记做到准确定，04143期：2008修回1—05—29位。细胞球体骨髓细胞的包埋采用国际上应用较多的、CB基金项目：国家自然科学基金资助项目(30371457)215004，(细胞块石蜡包埋)法132．旧0制作成蜡块熔化。作者单位：苏州大学附属第二医院脑循环室作者简介：霍红梅女主管技师，，。，苏州．受体蜡块的制作，Leic、a石蜡按，25％．～5％Tel：(0512)67783674Email：tao的比例加入适当蜂蜡反复熔化静置3次以上以去除杂，。huo@163．eom质。趁热浇入模具中室温冷却凝固后取出，空白蜡块36(Min／Min)或者apcapc(Min／+)，。330bp处的特征性条带是(Min／+)小鼠特有的若出现该条带并伴有619bp的条，*躺胁／＼籼＼‰／＼撇瘫僦带说明该子代小鼠为+蛳apc(Min／+)。另外因，，Ap…“c与Ape两条电泳带所代表的DNA序列不同测序时特别需要注。意引物的选择IMR0033Ape，根据图1的引物设计原理若使用引物，…“条带。330bp左右长度的序列将无法测得便，‰／＼f＼M‰№懒枞枞舢纵M图3D03删所含)；D0失去鉴别意义IMR0078，倘若用ApcApe+(Min／+)小鼠的特征性引物apc…“只能测得(／)小鼠的，条带序列。因此测序时推荐使用引物IMR0034apc能同时对两种条带序列进Apc行测序因第。需要强调的是PCR(Min／+)突变小鼠特指基Min基因突变小鼠ape+基因测序验证图850号密码子出现无义突变(TFG，~TAG一)的，C57BIV6JB0608140为野生型条带却c…“序列图(6bp19bp2品系小鼠非对称检测方法与测序结果，致只需普通B0608139为突变型条带却c序列图(330所含)琼脂糖凝胶电泳即分辨即可方法简单可靠。参考文献：3讨论[1]盛弘强陈，俭来茂德，．．Min基因突变小鼠模型在肠道肿瘤，小鼠却c基因定位在第有90％18号染色体与人类，APC基因Apc研究中的应用[J]遗传，200830te(3)，2：77282．的同源。Min一基因突变小鼠主要的遗传学特征是[2]souLK，KinzlerKWa，VogelstationinBteta1．Multipleinetestinoalne基因两条链中其中现619bp条链发生无义突变DNA。电泳结果若仅出，plasiaecausedbyncemuinhemurin—ho670mologftheAPC处的条带则表明提取是成功的同时又可以(+gen[J]．Scie，1992，256(5057)：668．提示该子代小鼠野生型的即apc／+)而不可能是，Ape维普资讯 http://www.cqvip.com

临床与实验病理学杂志JClinExpPathol242008Aug；(4)󰀀493󰀀mmY26mmxl5mm大小在此蜡块26，．mmy21mm范围内率．。用组织芯片仪打孔(15mm)制成12×10共120点阵芯片56℃31温度的控制。温度的控制非常重要贯穿芯片制作的，，的模块133．．。整个过程组织芯片的制备(1)受体蜡块的制作时应用莱卡蜡制作受体蜡℃左右。将供体蜡块预先置于．烤箱块时室温最好控制在25，外界温度不能控制时可，中预热用芯片仪(直径，，15mm针头)穿刺蜡块上标记处组。调整加入蜂蜡的比例5％以上，，。如在冬季可增加加入蜂蜡的比例至。织取出后准确放入空白蜡块的相应4qL内1从空白腊块第。以增加柔韧性(2)浇蜡时应趁热快速浇入模具，。排第2孔开始依次直至将所有标本植于空白蜡块中，将盒中可防止气泡的产生(3)捞片时应用凉水尤其在夏，，。做好的蜡块置于烤片机上明可见，一60℃熔蜡从侧方见蜡融化至透，，，季可在水中放入冰袋或冰块以防止切片溶化(4)切片的侧组织芯时立即关掉电源自然冷却后拔下置于。储存4℃一。次性切好的切片经烤片后暂时不用时最好置于，，。冰箱中储存134．．冰箱储存。若置于室温时间过长做免疫组化时抗原易，组织芯片的切片扯m蜡块在，4oc冰箱预冷，4h，后取丢失32．出切片机上作4，连续切片用凉水漂片温度不够可加，蜡块位点的移位，移位的产生主要由外力和气泡引一冰块m。40℃o温水中展片用防脱载玻片捞片，。60℃烤片30起致。要防止移位应注意：(1)取样蜡芯的长短最好尽量。in，58C继续烤片18h4oC保存待用。取出数张作常规陋]蜡芯的长短不一，加热时留下的空间会成为气泡大，HE．染色和免疫组化染色．。的气泡会影响位点的位置n。因此取样前供体蜡块先置于3，37，135免疫组化。采用EnVisio法按照常规免疫组化步，℃烤箱中预热”J。。每取样2—个标本时应擦拭一次取样针一骤操作14．并及时调整取样针的高度以保障所取样芯的长短大体组织芯片残缺组织点排除标准、、结果分析”J：(1)组致(2)熔蜡时整个蜡块在烤片机上加热时应密切注，，织点内不含目标组织；(2)组织点残缺掉片剩余面积小于原有面积的50％；意外界不要有振动等外力影响见．一。从侧方见蜡融化至透明可，。(3)组织点中所含待测样本面积小于组织侧组织芯时即关闭电源自然冷却脱片的问题。，芯原有的织点210％；(4)组织点折叠影响观察或未折叠部分不符，33要防止脱片应注意以下事项：(1)最好合以上(2)和(3)；(5)移位严重无法确定其原始定位的组。使用防脱载玻片电源且应用含，(2)抗原修复时液体沸腾时应立即关闭，排除以上组织点后计算出组织芯片利用率，。EDTA的修复液比用枸橼酸钠的较容易脱，片结果1。(3)烤片时间不应过长以不超过60℃2h为宜；温度不应过总高以不超过，为宜HJ。2．组织芯片蜡块。蜡块包含，118个点阵外观无缺失，。通过控制以上影响因素我们提高了制片的成功率，，，。蜡块无明显裂纹，熔蜡后有3个点阵发生了移位但移动，、之组织芯片的制作过程尚需要不断的实践摸索以更好地距离不大未与其他点阵相接触重叠22．。完善这一制作技术：。捞片。共捞片90张其中完整(包含有所有位点)的片，参考文献[1]Konthro子有65张23．HE、染色和免疫组化观察，2，张HE染色未发生点阵，onenJBubendofLKallionie，，miAr，eta1Mic．roarraysfo．rhigh󰀀移位脱片各点阵染色均匀清晰层次分明与原始HE切2ughput，molecularprofiling847．oftumospecimens[J]NatMed，片比较无明显差异，—。3张免疫组化切片中有，2张切片有19984(7)，8：44．—3个位点丢失讨论。芯片利用率在80％一90％[2]。张智慧孙耘田免疫细胞化学在细胞病理学中的应用[J]中．华病理学杂志3，200534，(10)，：672，—673tass．．[3]VemimmenD，GuedersMgenPisvinSoverexe1Difio：nerentmechanisnamsareimplicatedinERBB2BrJCaneprein—brea906．stdinother目前的组织芯片制作仍以手工或半手工为主尚无法像，caIlcers[J]．．cer，200389，．(5)899基因芯片那样实现全自动化因此在制作过程中不可避免地，[4][5]邓步华临床病理检验[MJ上海：上海科学技术出版社2005：，容易受到人为和外界因素的干扰影响了制片的质量和稳定，15，18．性。为此我们在制作过程中通过反复不断地实践摸索对。，，孙保存张试武赵秀兰等组织芯片制作过程中的体会和注，，．可能的影响因素进行分析改进提高了制片的质量和成功，、，意事项[J]临床与实验病理学杂志．，2002，18(6)：658—659．