质粒提取常见问题及解决办法

列中。解决办法：

质粒提取常见问题及解决办法

　　【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：

冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

　　涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死?

　　3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造

　　参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序

后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，

　　参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精

　　2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，

　　原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?

　　1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

使得质粒复制更加稳定。

成的，请大家注意一下!

　　参考见解：

更换具有相同功能的高拷贝数载体。 　　未提出质粒或质粒得率较低，如何解决?

要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】

　　1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如

　　2、肉眼观察活化菌株。 对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到

不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度

后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此

的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只

　　2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可

　　3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接

　　1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜

片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

延长溶解时间。

是否正确。

质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

　　7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或

菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍

　　5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温

　　9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会

　　6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量

　　4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少

　　8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若

前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。 有利于提高洗脱效率。

　　10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液

　　细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状?

回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

　　2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，

洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过

EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大

　　12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min

　　11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大

　　1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取

80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，

　　参考见解：

可达到较好的效果。

多杂志。

　　参考见解：

质粒丢失等不明原因。

　　溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清。

只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。

但是RNA很亮(没加RNA酶)?

(安全考虑，慎重)，只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太

其是对于试剂盒提取要注意)另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提

　　4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，(尤

吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较

　　1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其

　　3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培

养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，

　　为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清?提出来的条带几乎没有，

DNA明显的条带。

也会导致质粒产率低下.

是很亮的，要去除干净就要用比较好的RNA酶。

是否是有效的?如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀? 　　裂解不完全,参考见解： 研磨等),然后使用一般的发放。 　　5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。

　　2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。

　　加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变?

　　1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10%SDS是否是澄清的?NaOH

多)，很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温

　　3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高.如果是使用自己配的试剂，

　　4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化(数量变

建议做中提或大提;或者买试剂盒提.用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA

　　2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这

此文章由广州深华生物技术有限公司编辑修改。

胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。

种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑

　　3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这