重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第９期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ ＮＯ．９） 一１ ３２７一 基础研究 文章编号：０２５３—３６２６（２０ １ ０）０９—１ ３２７—０５ 创伤性脑损伤后高血糖对脑神经元损害作用的研究 王 亮，陈 亮，杨 刚，唐文渊 （重庆医科大学附属第一医院神经外科，重庆４０００１６） 【摘要】目的：探讨大鼠创伤性脑损伤后高血糖对神经元的损害作用。方法：成年雄性ＳＤ大鼠随机分成正常对照组，创伤性脑 损伤（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＴＢＩ）组和胰岛素治疗组。每组伤侧及健侧皮层设立自身对照。分别测定各组伤前伤后各时间点血糖 值，逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ～ＰＣＲ）测定伤后伤侧及健侧皮层葡萄糖转运蛋白３（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ３，ＧＬＵＴ一３）基因表达， Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法测定伤后伤侧及健侧皮层ＧＬＵＴ一３蛋白表达，免疫荧光法测定伤后各组伤侧及健侧皮层单个神经元神经特异性 烯醇化酶（Ｎｅｕｍｎｓ ｃｊ ｃｅｎｏ１ａｓｅ，ＮＳＥ）表达量和ＮＳＥ阳性染色细胞数，ｌｏｎｇａ评分、平衡木试验、网屏试验综合评定伤后各组神 经功能。结果：正常对照组各时间点血糖值，ＧＬＵＴ一３表达量，单个神经元ＮＳＥ表达量及ＮＳＥ阳性细胞数均未见明显变化；ＴＢＩ 组动物伤后血糖升高，伤侧皮层ＧＬＵＴ一３表达增加，单个神经元ＮＳＥ表达量增加而ＮＳＥ阳性染色细胞数明显减少神经瘫裂较 重；胰岛素治疗组伤后血糖变化不明显，伤后１２、２４、４８、７２ ｈ ＧＬＵＴ一３表达量，单个神经元ＮＳＥ表达量及ＮＳＥ阳性染色细胞数 均明显多于ＴＢＩ组神经瘫裂程度明显轻于ＴＢＩ组。各组健侧皮层ＧＬＵＴ一３和单个神经元ＮＳＥ表达量，ＮＳＥ阳性染色细胞数均 未见明显变化。结论：ＴＢＩ后高血糖可加重神经元损伤，其机制可能与ＴＢＩ后高血糖抑制伤后神经元ＧＬＵＴ一３的表达，增加伤后 神经元葡萄糖代谢障碍有关。 【关键词】创伤性脑损伤；高血糖；葡萄糖转运蛋白３；神经元特异性烯醇化酶 【中国图书分类法分类号】Ｒ７４１．０２；Ｒ３６１ 【文献标识码】Ａ 【收稿日期】２００９—１１－０２ Ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ＷＡＮＧ Ｌｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＮｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｏｆ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｄｕｈ ｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ：ｎｏｒｍａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｏｕｐ，ｇｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｋｉｌｌｅｄ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｒ～Ｉ—ＰＣＲ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＬＵＴ一３ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ＧＬＵＴ一３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＮＳＥ ａｎｄ ＮＳＥ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｌｏｎｇａ，ｂａｌａｎｃｅ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ ｔｅｓｔ ｓｃｏｒｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｎｅｕｒａｌ ｆｎｕｃｔｉｏｎａ］ｄｅ￣ｃｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｉｎ ｔｒａｕｍａｒｉｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｇｒｏｕｐ．ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＬＵＴ－３ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＮＳＥ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｔｈ ｉｎ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕ ｒｙ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｍｏｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＬＵＴ－３ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＮＳＥ ｂｕｔ ｌｅｓｓ ＮＳＥ ｐｏｓｉｔｉｖｅ－Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｔ １ ２，２４，４８，７２ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｉｎｊｕｒｅｄ ｓｉｄｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ ａｆｔｅｒ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＧＬＵＴ一３． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ；Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ；Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ３；Ｎｅｌｌｍｎ ｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ 神经元作自身糖原及能量底物 备量极低，需通过持续 摄人血液葡萄糖代谢供能才能维持其结构和功能的完整。葡 同等程度高血糖或低血糖在不同时间ｌ ２Ｉ和不同疾病模型 中ｌ ３＿ 对其表达影响明 不同。临床研究显示创伤性脑损伤 （Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＴＢＩ）后会有不通程度的血糖升高［５１，且 萄糖是极性分子，必需通过特异性分布于神经元胞膜的葡萄 糖转运蛋白３（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ３，ＧＬＵＴ一３）介导才能从其 胞外转运至胞内 Ｉ。目前研究显示脑内ＧＬＵＴ一３表达可能受 周围葡萄糖浓度的影响，但这种影响具有明 的不同定性， 作者介绍：王 亮（１９８３一），男，硕士， 研究方向：创伤性脑损伤后脑能量代谢变化及相关机制。 其升高水平直接预示着患者的预后 。能量代谢障碍是ＴＢＩ 后一切继发性损伤的根源，ＴＢＩ后高血糖是否通过影响伤后 ＧＩ ｕＴ一３的表达，影响ＴＢＩ后神经元能量代谢，加重脑损伤， 目前国内外均未见相关文献报道。故本文以伤后神经元为研 究对象，通过观察伤后皮层神经元ＧＬＵＴ一３，单个神经元神经 元特异性烯醇化酶（Ｎｅｕｒｏｎｓｐｅｃｉｉｆｃｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）表达及ＮＳＥ 通讯作者：唐文渊，男，教授，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｌｄ７３０＠１６３．ｃｏｍ。 一１ ３２８一 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第９期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．９） 阳性染色细胞数和伤后大鼠神经功能的变化，探讨ＴＢＩ后高 血糖对神经元的损害作用。 １材料及方法 １．１ 实验动物及分组 清洁级雄性ＳＤ大鼠，体重（２５Ｏ．４９±１２．８１）ｇ，随机数字 抽样法分成正常对照组，ＴＢＩ组，胰岛素治疗组，每组又各设 正常，伤后６、１２、２４、４８、７２ ｈ ６个时间点，每组每个时间点 各ｌＯ只，５只用于免疫荧光标本的采集，５只用于ＲＴ—ＰＣＲ 及Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ用标本的采集。各鼠均取造模前及处死前尾 静脉血，采用Ｊｏｈｎｓｏｎ公司Ｏｎｅ—ＴｏｕｃｈⅡ型微型血糖仪测其 血糖值。 １．２主要仪器及试剂 脑外伤头颅打击器；紫外分光光度计；ＰＣＲ仪；凝胶成像 仪；半干转机仪；ＬＥＩＣＡ显微镜；ＮＳＥ，ＧＬＵＴ一３和１３一ａｃｔｉｎ抗 体；ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ，Ｔｒｉｚｏｌ试剂；ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒； ＳＡＢＣ法免疫组化试剂盒；ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒；ＥＣＬ 化学发光试剂盒；中效低精蛋白锌胰岛素。 １Ｉ３动物模型的制作和标本的收集 伤前动物禁食禁水８ ｈ。采用刘嫒等人 的方法制作中型 ＴＢＩ模型。伤后动物均采用鼻饲法喂养。胰岛素治疗组大鼠 于伤后即刻皮下注射中效低精蛋白锌胰岛素１．０ Ｕ，后每１２ ｈ追加１．０ Ｕ，同时每天测随机血糖４次，如遇血糖降低即刻 腹腔注射１０％葡萄糖液予以纠正，以维持血糖在伤前正常 范围。正常对照组动物不做致伤处理，但禁食禁水和鼻饲法 喂养同ＴＢＩ组和胰岛素治疗组。选取伤侧损伤周围２ ｔｒｉｍ内 及健侧对称部位脑皮层为观测区 ，免疫组化标本经心灌注 ４％冷多聚甲醛固定后断头取脑，以前后囟连线中点为基线 冠状位切取４ ｍｍ厚（基线前后各２ ｌｑ＇ｌｍ）完整脑片按常规制 作成石蜡包埋块。ＲＴ—ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ用标本于深度麻 醉动物后断头取脑，迅速选取损伤周围２ ｉｉｌｍ范围内及健侧 对称部位皮层脑组织均分两份置于液氮中保存。 １－４相关指标的测定方法及步骤 １．４．１ ｌｉｔ—ＰＣＲ法测观测区皮层神经元ＧＬＵＴ一３ｍＲＮＡ表达 测定按Ｔｒｉｚｏｌ试剂说明书步骤提取总ＲＮＡ，紫外分光光度 计分析纯度后一８０＇１２保存备用。采用Ｐｒｉｍｅｒ５引物设计软件 设计ＧＬＵＴ一３和Ｂ—ａｅｔｉｎ上下游引物（见表１），委托上海生 物技术有限公司合成。ＲＴ扩增条件：３０％１０ ａｒｉｎ，５０￣Ｃ ３０ ａｒｉｎ，９４ｏＣ ５ ａｒｉｎ；ＰＣＲ扩增条件：９４￣Ｃ ２ ａｒｉｎ，９４￣Ｃ ３０ ｓ，５５ ｏＣ 表１ ＲＴ—ＰＣＲ用ＧＬＵＴ－３及Ｂ—ａｃｔｉｎ引物序列及片段大小 ３０ ｓ，７２￣Ｃ ３０ ｓ，循环３０次。产物经琼脂糖凝胶电泳分离；采 用Ｑｕａｎｉｔｙ—Ｏｎｅ图像分析软件测定ＲＴ—ＰＣＲ产物带吸光度、 本底吸光度和条带面积，计算出条带积分光密度，用ＧＬＵＴ一３ 条带积分光密度值与内参１３一ａｅｔｉｎ积分光密度值比值表示 该样本ＧＬＵＴ３ ｍＲＮＡ的表达水平。 １＿４．２ Ｗｅｓｔｅｒｎ—ｂｌｏｔ法检测各组观测区皮层神经元ＧＬＵＴ一３ 表达脑组织加人细胞裂解后冰上匀浆，按ＢＣＡ蛋白浓度 测定试剂盒测定蛋白浓度，加人２ Ｘ ＳＤＳ加样缓冲液，经煮沸 和超声粉碎，离心，每个泳道上样５０ ｇ总蛋白，进行ＳＤＳ— ＰＡＣＥ凝胶电泳，再将蛋白带半干电转移到ＰＶＤＦ膜上，用含 ５０ 脱脂奶粉的ＴＢＳＢ缓冲液室温下封闭膜２ ｈ，后加入 １／３００稀释的ＧＬＵＴ一３或１／４００稀释的１３一ａｅｔｉｎ抗体４℃过 夜，再加１／２ ０００稀释的山羊抗兔二抗室温孵育１ ｈ，ＥＣＬ法 显影，采用凝胶成像系统分析条带吸光值。 １．４．３免疫荧光法测观测区皮层单个神经元ＮＳＥ表达量及 ＮＳＥ阳性染色细胞数石蜡包埋块５ ／１＇２厚冠状位切片，常 规脱蜡至水，微波修复抗原，３‰Ｔｒｉｔｏｎ ｘ一１００破膜３０ ｒａｉｎ， ＢＳＡ封闭液３７℃４０ ａｒｉｎ，不洗，直接滴加１／２００稀释的ＮＳＥ 多克隆抗体４℃过夜，３７℃复温４５ ｒａｉｎ，ＰＢＳ洗涤５ ｒａｉｎ ３ 次，滴加ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ，避光３７℃作用４０ ａｒｉｎ，避 光ＰＢＳ洗涤５ ａｒｉｎ ３次，封片后荧光倒置显微镜下观查摄像 并保存，采用ｉｍｐｒｏ—ｐｌｕｓ６．０图像分析软件分析每个视野平均 荧光强度（Ｍｅａｎ ｄｅｎｓｉｔｙ，ＭＤ）和阳性染色细胞数，并以此计算 出单个神经元ＭＤ值（视野平均荧光强度／阳性染色细胞数）。各 组阴性对照用ＰＢＳ代替一抗，其余步骤同前。 １．４．４大鼠神经功能评定采用Ｌｏｎｇａ评分法、平衡木实 验、网屏实验评定动物神经瘫痪程度，具体评分标准。Ｌｏｎｇａ 评分法：０分，正常；１分，不能完全伸展左前肢，轻度神经功 能缺损；２分，行走时向侧转圈，中度神经功能缺损；３分，行 走时向左侧跌倒，重度神经功能缺损；４分，不能行走及ｊ薛识 水平下降。平衡木实验评分标准：０分，能跳上平横木，在上 面行走不会跌倒；１分，能跳上平横木，在上面行走，跌倒机 会小于５０％；２分，能跳上平横木，在上面行走，跌倒机会大 于５０％；３分，在健侧后肢帮助下能跳上平横木，但受累的瘫 侧后肢不能帮助向前移动；４分，在平衡木上不能行走，但可 坐在上面；５分，将鼠放在平衡木上会掉下来。网屏实验评分 标准：０分：前爪握住网屏大于５ ｓ，不会掉下来；１分；暂时握 住网屏，滑落一段距离，但没有掉下来；２分，在５ ｓ内掉下 来；３分：网屏转动里，鼠即刻掉下来。 １．５统计学分析 计量资料采用 ±Ｓ表示，采用ＳＰＳＳ １３．０统计软件进行 处理，两组间均数比较采用ｔ检验，多组间均数间比较采用 方差分析，ＧＬＵＴ一３表达量与ＮＳＥ阳性表达的相关性采用相 关分析。 ２结果 ２．１创伤性脑损伤后血糖值变化 各组伤前血糖差异不明显（尸＞０．０５）；ＴＢＩ组血糖于伤后 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第９期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．９） 一１ ３２９— ６ ｈ开始升高，２４ ｈ达到顶峰，４８ ｈ开始下降，７２ ｈ仍高于正 常水平；胰岛素治疗组和正常对照组伤后各时间点血糖变化 不明显（Ｐ＞０．０５），见图ｌ。 异不明显；正常对照组各时间点伤侧观测区皮层单个神经元 一１九。Ⅲ） 目 ＮＳＥ表达变化不明显；ＴＢＩ组和胰岛素治疗组伤侧观测区皮 ７ ６ ５ ４ ３ ２●Ｏ 层单个神经元ＮＳＥ表达都于伤后１２ ｈ开始升高，持续高表 ２．２创伤性脑损伤后观测区皮层神经元ＧＬＵＴ－３ｍＲＮＡ表达 达致伤后７２ ｈ，胰岛素治疗组伤后ｌ２、２４、４８、７２ ｈ单个神经 元ＮＳＥ表达量明显高于ＴＢＩ组，如表３。 ２．５创伤性脑损伤后观测区皮层神经元ＮＳＥ阳性染色细胞 数变化 见表２。正常对照组伤侧观测区皮层脑组织各时间点神 经元ＧＬＵＴ一３表达变化不明显（ＪＰ＞０．０５）；ＴＢＩ组伤侧观测区 皮层神经元ＧＬＵＴ一３表达于伤后１ ２ ｈ开始增加，一直持续到 伤后７２ ｈ胰岛素治疗组伤后ｌ２、２４、４８、７２ ｈ伤侧观测区皮 层神经元ＧＬＵＴ一３表达明显高于ＴＢＩ组；各组健侧皮层相应 部位皮层神经元ＧＬＵＴ一３表达变化不明显（Ｐ＞０．０５）。 正常情况下，ＮＳＥ分布于神经元胞桨，免疫荧光可见神 经元胞桨有绿色荧光标记，如图２。各组伤后健侧观测区皮 层ＮＳＥ阳性染色细胞数差异不明显；正常对照组各时间点 伤侧及健侧观测区皮层ＮＳＥ阳性染色细胞数差异不明显； ＴＢＩ组和胰岛素治疗组动物伤侧观测区皮层ＮＳＥ阳性染色 细胞数均于伤后６ ｈ开始降低，持续降低致伤后７２ ｈ，但胰 岛素治疗组伤后１２、２４、４８、７２ ｈ ＮＳＥ阳性染色细胞数显多 于ＴＢＩ组。如表４。 ２．６大鼠神经功能评定结果 ２－３创伤性脑损伤后观测区皮层神经元ＧＬＵＴ－３蛋白表达 见表３。正常对照组各时间点ＧＬＵＴ一３表达变化不明显 （Ｐ＞Ｏ．０５）；ＴＢＩ组大鼠ＧＬＵＴ一３表达于伤后１２ ｈ开始升高， 持续增高致伤后７２ ｈ；胰岛素治疗组伤后ｌ２、２４、４８、７２ ｈ神 经元ＧＬＵＴ一３表达均明显高与ＴＢＩ组伤后各组各时间点健 侧皮层神经元ＧＬＵＴ一３表达变化不明显（Ｐ＞０．０５）。 ２．４创伤性脑损伤后观测区皮层单个神经元ＮＳＥ表达 各组各时问点健侧观测区皮层单个神经元ＮＳＥ表达差 ＴＢＩ组大鼠神经功能评定结果于伤后６ ｈ开始降低，持 续降低至伤后７２ ｈ；胰岛素治疗组伤后ｌ２、２４、４８、７２ ｈ大鼠 正常对照组 伤后６ ｈ 伤后１２ ｈ 伤后２４ ｈ 伤后４８ ｈ 伤后７２ ｈ 注：・与正常对照组相比Ｐ＜０．０５； 与单纯脑外伤组相比Ｐ＜０．０５ 图１ 大鼠创伤性脑损伤后血糖值变化 表２大鼠创伤性脑损伤急性期皮层ＧＬＵＴ一３ ｍＲＮＡ表达 ±Ｓｌｎ＝５） 注：・与正常对照组相比Ｐ＜０．０５；・与单纯脑外伤组相比Ｐ＜Ｏ．０５ 一１ ３３０一 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第９期《Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．９ 神经功能评定结果明显优于ＴＢＩ组。见表６。 ２．７创伤性脑损伤后观测区皮层神经元ＧＬＵＴ一３表达量与 ＮＳＥ阳性染色细胞数相关性分析。 ３讨论 ＴＢ１后观测区皮层神经元ＧＬＵＴ一３表达量与ＮＳＥ阳性 染色细胞数呈正相关（ｒ＝０．９０１，Ｐ＜０．０１）。 脑内糖原其含量很低【３．３ ｍｍｏｌ／（ｋｇ・鼠）】，酵解供能仅能 维持大脑５ ｍｉｎ左右正常活动；同时因脑细胞代谢率高，耐受 图２免疫荧光法测ＴＢＩ组各时间点ＮＳＥ阳性表达数（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ分别表示ＴＢＩ组正常、伤 后６、１２、２４、４８、７２ ｈＮＳＥ表达） 表４大鼠创伤性脑损伤后皮层单个神经元ＭＤ表达（Ｘ±Ｓ，ｎ＝５，免疫荧光法Ｘ４００） 重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第９期（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０．Ｖｏ１．３５ Ｎｏ．９） 一１ ３３１一 能源缺乏所致损伤的能力极弱，上述原因就使得脑对外来能 源物质的依赖性极大，同时也使得伤后能量代谢障碍成为脑 一切继发性损害的根源。脑的唯一常规底物葡萄糖是极性分 子，其被脑摄取利用必须依赖葡萄糖转运蛋白的介导。ＴＢＩ 后，脑水肿，血管痉挛等因数的综合作用使得无氧酵解成为 局部主要甚至是唯一的供能方式 ，同时因葡萄糖的摄取是 无氧酵解的关键步骤，因此ＴＢＩ后局部葡萄糖蛋白的表达能 否相应的增加，也就成为伤后脑组织能否耐受伤后局部能量 代谢障碍的关键。ＮＳＥ是糖酵解过程中催化２一磷酸甘油酸 脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸的一种关键酶，特异性地存在于 神经元胞浆，因其是糖酵解过程中的关键酶，其表达量也就 间接反应了神经元糖酵解的强弱；同时因其特异性的存在于 神经元胞浆，对其阳性表达细胞计数又可间接反应神经元缺 失的程度 Ｊ。ＴＢＩ后血糖升高，一方面可增加伤后脑葡萄糖供 应量；另一方面高血糖可提高血渗透压，有利于降低伤后脑 水肿，因此，从理论上讲，ＴＢＩ后高血糖应该对机体有利。然 而，Ｊｅｒｅｍｉｔｓｋｙ等人目的研究显示外伤后高血糖会对脑有明显 损害作用，这种损害是否通过影响神经元ＧＬＵＴ一３表达，减 少神经元葡萄糖摄取，加重伤后脑能量代谢障碍有关，目前 暂未见相关报道。 本研究资料表明，ＴＢＩ组伤后伤侧脑ＧＬＵＴ一３表达增加， 正常对照组伤侧ＧＬＵＴ一３表达却未见明显变化，提示ＴＢＩ是 导致伤侧ＧＬＵＴ一３表达增加的直接原因。ＴＢＩ创伤应激可兴 奋下丘脑一垂体一肾上腺糖皮质激素系统，产生大量的糖皮 质激素，研究显示…１，糖皮质激素会减弱ＧＬＵＴ一３转运葡萄糖 的能力，ＴＢＩ后ＧＬＵＴ一３表达的增加很有可能是脑应对 ＧＬＵＴ一３转运能力下调所做的一种代偿性反应ｌ１２】。应用胰岛 素控制ＴＢＩ性高血糖后，伤侧ＧＬＵＴ一３表达增加更加明显， 说明ＴＢＩ后高血糖有抑制伤后ＧＬＵＴ一３表达增加的作用。同 时本研究资料亦显示，ＴＢＩ后伤侧ＧＬＵＴ一３表达增加的同时， 健侧神经元ＧＬＵＴ一３表达变化并不明显，表明ＴＢＩ后损伤局 部可能存在着某些易损因子，其与ＴＢＩ后高血糖协同作用才 能抑制伤后ＧＬＵＴ一３表达的增加，未损伤侧正是由于缺少这 些易损因子，从而就表现出对ＴＢＩ后高血糖调控ＧＬＵＴ一３表 达作用的耐受性。目前，关于ＴＢＩ后局部易损因子的种类及 其与ＴＢＩ后高血糖协同抑制ＴＢＩ后神经元ＧＬＵＴ一３表达的 相关机制还不清楚。 本研究资料亦提示，降低ＴＢＩ后高血糖在增加ＧＬＵＴ一３ 表达增加的同时，单个神经元ＮＳＥ表达增加，ＮＳＥ阳性染色 细胞数亦明显增加，提示ＧＬＵＴ一３表达增加可增加神经元 ＮＳＥ表达（无氧酵解强弱的指标），减轻局部能量供应障碍所 致的神经元缺失，对减轻伤后脑功能的损害有明显保护作 用，也从神经元的角度应证了临床ＴＢＩ后控制血糖的临床必 要性 。从理论上讲，无氧代谢增加必然会造成细胞内过多酸 性代谢产物的聚集，细胞内酸中毒样又会加重细胞的损害， 本实验研究结果却提示，ＴＢＩ降糖治疗后无氧代谢的增加 （ＮＳＥ表达量增加）有利于伤后神经元的保存，其相关机理不 明，笔者认为可能与无氧代谢增加ＴＢＩ后脑局部能量供应， 相对减轻伤后Ｎａ 一Ｋ 一ＡＴＰ酶（Ｎａ泵），Ｎａ＋一Ｇａ２＋－ＡＴＰ酶（Ｇａ 泵）等离子泵活性下降水平ｌ１］１，相对增加伤后胞内代谢产物 排出率，进而相对减轻细胞内酸中毒水平有关。 参考文献